压电定向的中性粒细胞胞外陷阱在流感病毒感染期间调节巨噬细胞分化

　　

Piezo1 在流感病毒感染中调控免疫细胞功能的研究解读

北京师范大学生命科学学院细胞增殖与调控生物学教育部重点实验室的研究人员 Yuexin Wang、Qiuli Yang 等，在期刊Cell Death and Disease上发表了题为 “Piezo1-directed neutrophil extracellular traps regulate macrophage differentiation during influenza virus infection” 的论文。该研究揭示了离子通道 Piezo1 在流感病毒感染过程中，对中性粒细胞胞外陷阱（NET）形成以及巨噬细胞功能分化的调控机制，为深入理解抗病毒免疫应答提供了新视角，有望为治疗病毒感染性疾病提供潜在的干预靶点 。

一、研究背景

中性粒细胞和巨噬细胞是抵御病原体微生物感染的重要免疫细胞。在病原体入侵时，中性粒细胞率先被招募到感染部位，通过吞噬、产生活性氧（ROS）等方式发挥抗菌作用，同时其释放的 NETs 也备受关注。NETs 由双链 DNA、组蛋白和非组蛋白蛋白质组成，在调节免疫反应中发挥重要作用。巨噬细胞则可分化为 M1 和 M2 两种类型，M1 型巨噬细胞分泌促炎细胞因子，增强免疫反应；M2 型巨噬细胞则分泌抗炎细胞因子，促进组织修复。然而，在流感病毒感染中，中性粒细胞如何调节巨噬细胞的功能尚不清楚。

Piezo1 作为一种机械激活的非选择性阳离子离子通道，对钙和镁离子具有显著通透性，参与多种细胞的增殖和发育调节。此前研究表明，Piezo1 在免疫细胞功能调节中发挥作用，但它对中性粒细胞功能的调控，尤其是在流感病毒感染期间的作用，尚未明确。

二、研究材料与方法

（一）实验动物

研究使用了 C57BL/6 Piezo1^flox/flox、Lyz-Cre、Sirt2^flox/flox和 Hif1a 等多种品系小鼠，均购自 Jackson Laboratory 或北京大学生物实验中心，并回交至 C57BL/6 背景至少八代，实验时选用 6 - 12 周龄小鼠。

（二）病毒感染模型

通过滴鼻方式，用 50 μl 剂量为 450 TCID₅₀（半数组织培养感染剂量）的小鼠适应型流感病毒 A/Puerto Rico/8/34（PR8，H1N1）感染小鼠，感染 48 小时后处死小鼠，收集支气管肺泡灌洗液（BALF）和肺组织进行后续分析。

（三）检测方法

采用多种实验技术进行检测分析，包括病毒滴度测定、组织病理学分析、免疫组化、中性粒细胞和巨噬细胞的分离培养、NET 形成测定、NET DNA 纯化、细胞培养与流式细胞术、定量 RT-PCR、RNA 测序、蛋白质免疫印迹以及统计分析等。

（四）关键技术路线

首先建立流感病毒感染小鼠模型，观察感染后免疫细胞变化。通过 RNA 测序筛选差异表达基因，发现 Piezo1 在病毒感染的中性粒细胞中表达上调。构建 Piezo1 条件性敲除小鼠，研究其对中性粒细胞和巨噬细胞功能的影响。利用体外共培养系统、体内过继转移模型等，探究 Piezo1 调控 NET 形成以及巨噬细胞分化的机制。

三、研究结果

（一）中性粒细胞 NET 形成和巨噬细胞分化与肺部呼吸道病毒感染相关

建立 PR8 流感病毒小鼠感染模型后发现，感染 48 小时后，小鼠肺部干湿重比下降，中性粒细胞和巨噬细胞浸润增多。浸润的巨噬细胞中 M1 型增多、M2 型减少，同时中性粒细胞产生更多 NETs、ROS 和 CXCR2，并诱导 PAD4 和瓜氨酸化组蛋白 H3（Cit-H3）表达上调。而且，中性粒细胞 NETs 的百分比与浸润巨噬细胞数量和 M1 型巨噬细胞分化程度呈正相关。

（二）Piezo1 在抗病毒免疫中对中性粒细胞 NET 形成至关重要

对感染和未感染病毒小鼠 BALF 中中性粒细胞进行 RNA 测序，发现病毒感染的中性粒细胞中 Piezo1 表达上调。体外实验中，用 Piezo1 激动剂 Yoda1 处理野生型小鼠脾脏中性粒细胞，结果显示 Piezo1 表达增加，NET 和 ROS 生成增多，PAD4 表达也增加。

（三）Piezo1 是抗病毒感染过程中中性粒细胞 NET 形成和巨噬细胞分化所必需的

构建髓系特异性 Piezo1 条件性敲除小鼠（Piezo1^-/-），感染 PR8 病毒并给予 Yoda1 处理。结果显示，Piezo1^-/-小鼠感染后，BALF 和肺部浸润的中性粒细胞和巨噬细胞数量与野生型小鼠相似，但 Piezo1 缺失导致中性粒细胞中 PAD4 表达、ROS 生成和 NET 形成减少，巨噬细胞中 TNFα 和 NOS2 表达降低；Yoda1 处理可部分恢复野生型小鼠的这些变化，但对 Piezo1^-/-小鼠无此效果。

（四）Piezo1 导向的中性粒细胞 NETs 在抗病毒感染中调节巨噬细胞分化

体外共培养实验表明，阻断 NET DNA 会减少 M1 型巨噬细胞相关因子（TNFα 和 NOS2）的表达，说明中性粒细胞产生的 NET DNA 可促进 M1 型巨噬细胞分化。用 LPS 或病毒诱导的中性粒细胞 NET DNA 处理巨噬细胞，得到相似结果。体内实验中，将 Piezo1^-/-小鼠中性粒细胞的 NET DNA 转移到野生型受体小鼠体内，受体小鼠病毒载量增加，巨噬细胞中 TNFα 和 NOS2 产生减少；用 DNase 预处理 NET DNA 可消除这些影响。此外，巨噬细胞耗竭实验显示，Piezo1 中性粒细胞 NETs DNA 诱导的 M1 型巨噬细胞分化对小鼠抗病毒免疫至关重要。

（五）中性粒细胞 NET DNA 通过 Piezo1 诱导的 TLR9 和 cGAS 信号调节 M1 型巨噬细胞分化

研究发现，Piezo1^-/-小鼠感染病毒后，巨噬细胞中 TLR9、cGAS、STING 和 IRF3 表达降低。体外实验中，用抑制剂阻断 TLR9 和 cGAS，或用 shRNA 敲低巨噬细胞中的 cGAS 和 STING，都会逆转 NET DNA 诱导的巨噬细胞向 M1 型分化的相关变化。这表明 cGAS - STING 信号通路是中性粒细胞 NET DNA 诱导 M1 型巨噬细胞分化所必需的，Piezo1 通过该通路发挥调控作用。

（六）Piezo1 通过 SIRT2 - HIF1α 信号在病毒感染期间指导中性粒细胞 NET 形成

RNA 测序和分子表达分析显示，Piezo1 缺失会降低中性粒细胞中 Sirt2、Hif1a 和 Pad4 的 mRNA 表达。构建 SIRT2 和 HIF1α 条件性敲除小鼠，结果表明 SIRT2 和 HIF1α 在 Piezo1 介导的中性粒细胞 NET 形成中起重要作用，它们参与调节 PAD4 - ROS 信号介导的 NET 形成。

（七）镁对 Piezo1 介导的抗病毒感染中 NET 形成是充足的

研究发现，阻断钙内流不影响 Piezo1 介导的中性粒细胞 NET 形成。在镁离子相关实验中，生理浓度的镁（0.6 mM）可增加 NET 形成以及 PAD4、SIRT2 和 HIF1α 的表达，Yoda1 处理可增强这些效果，但 Piezo1^-/-会消除这些变化，说明镁内流足以诱导 Piezo1 介导的中性粒细胞 NET 形成。

（八）镁感知的 Piezo1 导向的 NETs 在小鼠和人类抗病毒感染反应中调节 M1 型巨噬细胞分化

给野生型或 Piezo1^-/-小鼠喂食低镁饮食并感染 PR8 病毒，结果显示低镁饮食减弱了肺部炎症变化、中性粒细胞 NET 形成以及巨噬细胞 TNFα 和 NOS2 的产生。在人类细胞实验中，应用 Piezo1 激动剂 Yoda1 处理人中性粒细胞，发现镁离子可增强 NET 形成；在人中性粒细胞 - 巨噬细胞共培养系统中，激活 Piezo1 可促进人巨噬细胞中 NOS2 的产生，且镁离子可增强该效果。此外，用 Piezo1 拮抗剂 GsMTx4 处理感染病毒的小鼠，可抑制中性粒细胞 NET 形成和巨噬细胞 M1 型分化。

四、研究结论与讨论

本研究表明，离子传感器 Piezo1 在流感病毒感染应答中，指导中性粒细胞 NET 形成并调节 M1 型巨噬细胞分化。Piezo1^-/-的中性粒细胞 NET DNA 产生减少，导致 TLR9 和 cGAS - STING 信号活性降低，促使巨噬细胞从 M1 型向 M2 型分化。同时，Piezo1 整合镁信号和 SIRT2 - HIF1α 信号通路，通过中性粒细胞 NET 形成调控 M1 和 M2 型巨噬细胞的谱系定向分化。

此前研究虽揭示了中性粒细胞和巨噬细胞在免疫中的重要性，但对它们在病毒感染时的相互调控机制了解有限。本研究首次明确了 Piezo1 在中性粒细胞中的关键作用，拓展了对免疫细胞调控网络的认识。研究还发现，镁离子参与 Piezo1 介导的 NET 形成和巨噬细胞分化调节，低镁饮食可缓解病毒感染引起的炎症，这为临床呼吸道病毒感染的饮食管理提供了理论依据。

在未来研究中，可进一步探究 Piezo1 在其他病毒感染中的作用机制，以及 Piezo1 与其他免疫调节因子的相互作用关系。同时，基于本研究结果，针对 Piezo1 开发靶向治疗策略，有望为病毒感染性疾病的治疗开辟新途径。