SIV感染在恒河猴早期全身性感染中诱导额叶皮层基因表达的改变和中间神经元的丢失

　　

探究 SIV 感染早期恒河猴额叶皮质变化，为 HIV 相关神经认知障碍研究提供新视角

宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院精神病学系的 Richard C. Crist 等研究人员在《转化精神病学》（Translational Psychiatry）期刊上发表了题为 “SIV infection induces alterations in gene expression and loss of interneurons in Rhesus Macaque frontal cortex during early systemic infection” 的论文。该研究通过对恒河猴的实验，深入剖析了猴免疫缺陷病毒（SIV）感染早期恒河猴额叶皮质的变化，为理解人类免疫缺陷病毒（HIV）相关神经认知障碍（HAND）的发病机制提供了关键线索，有助于开发更有效的治疗策略，在艾滋病神经病理学研究领域具有重要意义。

一、研究背景

HIV 感染会引发一系列严重后果，其中 CD4 + T 细胞的进行性丧失会导致获得性免疫缺陷综合征（AIDS），患者死亡率因机会性感染大幅增加。中枢神经系统（CNS）也深受其害，未接受治疗的 HIV 感染者常出现神经系统症状、认知障碍和痴呆等，即 HAND。虽然现代抗逆转录病毒治疗显著降低了 HIV 感染者的全因死亡率，延长了生存期，但也使得轻度至中度 HAND 合并症的比例上升。

研究发现，HIV 感染者大脑额叶皮质中 γ - 氨基丁酸（GABA）能神经元标记物表达缺失，这与神经认知功能障碍有关，部分 HAND 患者的神经认知症状可能源于 GABA 能传递的失调。对 HIV 感染者死后大脑皮质组织的转录组分析表明，免疫反应、神经炎症和干扰素信号相关基因表达增加，同时调节线粒体功能、轴突导向和突触信号的基因表达也存在差异。然而，分析死后大脑组织存在诸多局限性，如无法分析感染过程中的变化、难以区分感染和治疗的影响，以及常伴有精神疾病和物质使用障碍等共病情况。

动物模型可在一定程度上弥补这些缺陷，SIV 作为 HIV 的进化前体，能在恒河猴等非人灵长类动物中诱发 AIDS，被广泛用于 HIV 发病机制的研究。SIV 感染的恒河猴会出现类似 HAND 的神经认知症状，其死后大脑组织基因表达也发生改变。此前研究多使用组织裂解物分析，无法确定细胞类型特异性变化，且对 SIV 感染不同细胞类型的神经转录组影响了解有限，急性 SIV 感染对不同细胞类型转录组的瞬时和持续影响也尚不明确。因此，本研究旨在利用单细胞核转录组学技术，深入探究 SIV 感染早期恒河猴额叶皮质的变化。

二、研究材料方法与技术路线

（一）实验动物及伦理

实验动物为健康的 32 - 38 月龄 Mamu - A*01 阳性（MHC - I 类）印度恒河猴，实验动物操作经埃默里大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，遵循《动物福利法》及其他联邦法规，动物饲养于埃默里大学耶基斯国家灵长类研究中心（YNPRC），并由 AAALAC 认证的动物资源部门监管。对照组织由卡约生物银行研究单位（CBRU）提供。

（二）动物感染与组织采集

选取 Mamu B08 和 Mamu B17 阴性的恒河猴，静脉注射 500 个 50% 组织培养感染剂量（TCID50）的 SIVmac251。分别在感染后 10 天和 20 天对动物进行尸检，采集大脑组织并立即冷冻保存于 - 80°C，随后运送至宾夕法尼亚大学。同时采集 CBRU 中未感染的年龄和性别匹配恒河猴的大脑组织作为对照。

（三）细胞核分离、文库制备与测序

将冷冻的额叶皮质样本在裂解缓冲液中匀浆，经过一系列稀释、静置和离心操作，制备细胞核悬浮液。将细胞核悬浮液加载到 10× Genomics 微流体控制器上，按照制造商协议使用 3′ Gene Expression Kit v3.1 制备测序文库，将所有样本的文库等摩尔浓度混合后在 NovaSeq 6000 S4 流动细胞上进行测序，测序数据经 CellRanger v3.1.0 解复用并与最新的恒河猴参考基因组（Mmul10）比对。

（四）质量控制、聚类与注释

对测序数据进行质量控制，去除低基因计数、高 UMI 计数以及线粒体转录本比例过高的细胞核数据。使用 Seurat 4.0.6 软件对数据进行归一化、缩放处理，基于高度可变基因生成主成分，进行聚类分析。通过已知的细胞类型标记物，如周细胞的 VIM、小胶质细胞的 CX3CR1 等，识别不同的细胞类型，经过多次筛选和聚类，最终得到 15 个细胞群。

（五）定量与分析

利用 R 包 scProportionTest 中的置换检验比较病例组和对照组中各细胞群的细胞比例。采用伪批量方法和 EdgeR 似然比检验（LRT）识别差异表达基因（DEGs），通过 Bonferroni 校正进行多重检验校正，筛选出校正 p 值 < 0.001 且在感染组和对照组间表达差异至少 50%（绝对 log2 倍变化≥0.59）的基因作为显著差异表达基因。运用 Ingenuity Pathway Analysis（IPA）核心分析功能和 Functional Mapping and Annotation（FUMA）的 GENE2FUNC 分析等方法，对差异表达基因进行功能注释和信号通路分析。

（六）免疫组织化学

对不同时间点的福尔马林固定、石蜡包埋的额叶皮质组织块进行切片、脱蜡、水化等处理，通过抗原修复、封闭、孵育一抗和二抗等步骤，利用 avidin - biotin 辣根过氧化物酶系统放大信号，使用二氨基联苯胺和过氧化氢显色，苏木精复染，最后在数字切片扫描仪上成像，用 QuPath 软件分析图像，以平均 ± 标准误（SEM）表示为分析视野中阳性像素的百分比，在 SPSS 中使用广义线性模型和 LSD 事后检验进行统计分析。

三、研究结果

（一）SIV 感染后皮质 GABA 能中间神经元减少

对感染 SIV 10 天和 20 天的恒河猴以及对照动物的额叶皮质组织样本进行单细胞核 RNA 测序（snRNAseq）。经质量控制后，共获得 69,151 个细胞核用于分析，测序深度和质量在感染组和对照组间无显著差异。通过聚类分析鉴定出 15 种细胞类型，感染动物与未感染动物相比，细胞群比例存在显著差异。小胶质细胞在感染后 10 天和 20 天的比例显著增加，而周细胞比例显著下降。GABA 能中间神经元数量呈进行性减少，10 天时中间神经元核比例从 32.1% 降至 17.5%，SST + 和 CALB2 + 中间神经元群体显著减少；20 天时进一步降至 11.3%，所有中间神经元簇均显著减少。通过免疫组织化学检测 GAD67（GAD1 的蛋白产物），发现在感染后 10 天和 20 天，恒河猴额叶皮质灰质和白质中的 GAD67 染色均显著减少，证实了中间神经元的减少。

（二）SIV 感染诱导由瞬时机制调节的基因表达改变

采用伪批量策略和 EdgeR 分析 SIV 感染后 10 天和 20 天各细胞群的基因表达变化。10 天时发现 3490 个差异表达基因（1100 个上调，2390 个下调），20 天时差异表达基因减少至 1282 个（118 个上调，1164 个下调）。早期 SIV 感染存在时间点特异性和共享的差异表达基因，10 天和 20 天共享的差异表达基因大多下调（94.5%）。鉴定出 1065 个细胞类型特异性基因在两个时间点均差异表达，且表达变化方向一致，表明这些差异表达事件代表了早期 SIV 感染期间神经基因表达的持久变化。通过与 MSigDB 比较，发现神经元细胞类型在 10 天和 20 天、小胶质细胞在 10 天存在潜在调节差异基因表达模式的细胞类型特异性 microRNA 和转录因子，如 miR130a、miR181 以及干扰素反应因子、Ets 相关因子等。利用 IPA 预测上游网络主调节因子，发现 10 天时干扰素 lambda 1 是最保守的主调节因子，在所有细胞类型中均显著，其在病毒感染应答中具有重要作用。

（三）SIV 感染后细胞类型特异性分子通路的改变

比较时间点和细胞类型特异性差异表达基因与经典通路和基因本体，发现差异表达基因在不同细胞类型和时间点的共享和独特通路及本体中存在过表达现象。例如，“干扰素 αβ 信号传导”“免疫系统中的细胞因子信号传导” 和 “干扰素刺激基因的抗病毒机制” 等经典通路在 10 天时对所有细胞亚型均显著，但在 20 天时仅对内皮细胞类型显著；“对病毒的防御反应”“对病毒过程的负调控” 和 “对 I 型干扰素的反应” 等基因本体在 10 天时对所有细胞类型显著，20 天时则不显著，这些结果揭示了 SIV 诱导神经适应的时间机制。

（四）SIV 感染后细胞 - 细胞相互作用网络的时间变化

利用 Connectome 比较 FANTOM5 数据库中已知配体和受体对的转录水平变化，以了解额叶皮质神经细胞 - 细胞相互作用在 SIV 感染早期的变化。研究发现感染后 10 天和 20 天，配体和受体的表达存在时间点特异性改变，从而产生显著扰动的细胞类型 - 配体 - 受体 - 细胞类型相互作用效应。如在 10 天和 20 天，星形胶质细胞中编码细胞因子样糖蛋白的 Spp1 基因表达下调，其相互作用伙伴 Cd44 在一群兴奋性神经元中的表达也下调，导致星形胶质细胞 - Spp1 - Cd44 - 兴奋性神经元细胞 - 细胞相互作用失活，这些变化可通过 circos 图可视化，为进一步研究提供了线索。

四、研究结论与讨论

本研究利用无偏 snRNAseq 方法全面表征了 SIV 感染急性期（0、10 和 20 天）恒河猴额叶皮质细胞核的转录组谱，证实了 SIV 诱导的神经元损伤，并确定 GABA 能中间神经元是急性 SIV 诱导脑损伤的主要靶点。分析 69,151 个经过质量控制的细胞核，鉴定出 15 种不同细胞类型，并观察到抑制性中间神经元的时间依赖性减少。研究还发现细胞类型特异性的差异基因表达模式，以及细胞 - 细胞相互作用网络在感染早期的时间点特异性改变，这些结果为 HIV 和 SIV 神经病理学研究提供了新见解，有助于理解与 SIV 感染急性期相关的脑损伤潜在机制。

在大脑中，HIV 和 SIV 主要感染小胶质细胞和巨噬细胞，也可低频率感染星形胶质细胞和周细胞。周细胞对维持血脑屏障至关重要，SIV 感染会导致周细胞减少，进而破坏血脑屏障，可能引发神经元损伤和 HAND 相关症状。本研究观察到感染后 10 天和 20 天周细胞显著减少，未来需进一步研究周细胞变化的详细机制。

HIV 和 SIV 感染还会诱导神经病理效应，如兴奋性毒性损伤、免疫细胞细胞因子释放的神经毒性作用以及病毒蛋白对神经元的直接影响等，这些都可能导致神经元细胞丢失，与 HAND 症状的发生相关。已有研究表明，HIV 感染可能对不同脑区的特定神经元亚型产生不同影响，GABA 能中间神经元在 HIV 患者和表达 HIV - 1 Tat 的转基因小鼠中可能更为脆弱。本研究中，恒河猴额叶皮质中 SST + 和 CALB2 + 中间神经元在感染早期显著减少，而兴奋性神经元亚型数量无明显变化，同时小胶质细胞数量增加，这表明 SIV 感染可能迅速引发神经毒性效应，导致特定中间神经元亚型死亡。

额叶皮质中的 GABA 能抑制性神经元对调节工作记忆、社会行为和恐惧表达至关重要。SIV 感染导致这些神经元减少，可能改变神经连接组，进而解释 HIV / SIV 感染后的相关后遗症。早期干预维持这些神经连接组电路的稳定性，可能改善 HIV / SIV 感染相关的缺陷，这为未来研究提供了方向。

此外，抗逆转录病毒治疗虽能减少 HIV 患者的神经元丢失，但仍有部分患者会发展为 HAND。研究发现 SIV 感染 10 天时，差异表达基因大多与先天免疫和细胞对病原体的反应相关，主要涉及干扰素信号传导。转录因子干扰素调节因子 2（IRF2）在 10 天时在三种兴奋性神经元亚型中上调，可能是未来干预的潜在靶点。到 20 天时，除内皮细胞外，所有细胞类型中干扰素和免疫相关基因的差异表达均停止，此时的转录组变化可能代表长期效应或对慢性感染的适应。例如，AZU1 基因在两个最大的中间神经元簇中上调，其在神经元中的表达增加与阿尔茨海默病相关，在 SIV 感染的恒河猴中，AZU1 的差异表达可能与 10 天时的急性炎症反应有关，未来需研究其对中间神经元的影响是促进死亡还是具有神经保护作用。

本研究也存在一定局限性，如 10 天和 20 天差异表达分析的样本量相对较小，增加样本数量可能会提高差异表达基因鉴定的可信度，并发现更多细胞类型特异性差异表达基因。此外，特定中间神经元群体在 20 天时显示出 HOXA4 和 NFκB 靶标的富集，这与 HIV Tat 蛋白相关，未来需确认 Tat 蛋白在该 SIV 模型中是否被特定神经元亚型内化。同时，研究还发现星形胶质细胞中 Spp1 基因表达减少，可能影响其与兴奋性神经元的相互作用，进而影响突触功能，这也为后续研究提供了方向。

总体而言，该研究为理解 HIV / SIV 感染相关的神经认知障碍提供了重要依据，确定的差异表达基因可能成为治疗 HAND 症状的潜在靶点。未来研究可在更多队列中重复这些发现，扩展到更多脑区和感染后期时间点进行分析，进一步明确 SIV / HIV 神经毒性的时间和性质，以及特定细胞类型丢失在 HAND 发展中的作用，为开发更有效的治疗策略奠定基础。