CREB1-BCL2在RAS gap依赖性乳腺癌化疗耐药中驱动线粒体弹性

　　

探秘三阴乳腺癌化疗耐药新机制：RASAL2 的关键作用

在癌症研究领域，三阴乳腺癌（TNBC）的治疗一直是一个重大挑战。来自英国布里斯托大学（University of Bristol）等多个单位的研究人员，在知名期刊Oncogene上发表了题为 “CREB1-BCL2 drives mitochondrial resilience in RAS GAP-dependent breast cancer chemoresistance” 的论文。这一研究成果揭示了 RAS GAP 与细胞凋亡调控之间此前未被记录的分子联系，为攻克三阴乳腺癌化疗耐药难题提供了全新的理论依据和潜在治疗靶点，在肿瘤治疗研究中具有重要意义。

一、研究背景

三阴乳腺癌是一种侵袭性强且异质性高的乳腺癌亚型，由于缺乏雌激素、孕激素受体以及 HER2 受体酪氨酸激酶的扩增，其预后在所有乳腺癌亚型中最差，复发率高且总生存期短。虽然 TNBC 肿瘤通常具有较高的基因组不稳定性和同源重组修复缺陷，理论上对 DNA 损伤剂（如铂类和拓扑异构酶抑制剂）敏感，但实际上这些标准化疗药物的响应率较低，这主要归因于疾病的显著生物学异质性。

化疗耐药是临床治疗中的一大难题，其中 RAS 通路的失调在多种肿瘤的化疗耐药中发挥重要作用。RASAL2 作为一种 RAS GTP 酶激活蛋白（GAP），其在肿瘤中的作用存在矛盾性。在一些癌症类型中，它作为肿瘤抑制因子，而在 TNBC、胰腺癌、结直肠癌和胃癌等侵袭性癌症中，却表现出致癌基因的特性。此前研究发现，RASAL2 在 TNBC 患者铂类化疗后预后最差的患者肿瘤中过表达，但它在介导治疗反应中的分子机制仍不清楚。

二、研究材料与方法

（一）细胞系与化学试剂

研究使用的细胞系来源于欧洲细胞培养物保藏中心（European Collection of Cell Cultures）或美国典型培养物保藏中心（ATCC），在添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素 / 链霉素的 RPMI 或 DMEM 培养基中培养，且传代不超过 25 次。实验中用到的顺铂、卡铂溶解于 0.9% 氯化钠溶液，其他药物（如多柔比星、吉西他滨、SN38、星形孢菌素）则溶解于二甲基亚砜（DMSO），并确保实验中 DMSO 终浓度≤0.2% 。

（二）慢病毒转导与 siRNA 转染

通过慢病毒转导技术，将携带目的基因的慢病毒载体转染至 HEK293T 细胞，再收集含有慢病毒颗粒的条件培养基，转导靶细胞，并用嘌呤霉素筛选稳定转导的细胞。对于 siRNA 转染，按照制造商的说明，使用 Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂将人特异性 siRNA 转染到细胞中，72 小时后收集细胞进行后续分析。

（三）细胞活力测定

采用 CellTiter-Glo 发光检测法或结晶紫染色法测定细胞活力。细胞在 96 孔板中接种 24 小时后，进行药物处理，然后按照相应试剂盒的说明操作，检测细胞活力。

（四）患者样本收集

在获得适当伦理批准和患者知情同意后，收集 TNBC 患者的乳腺肿瘤和相邻正常乳腺组织样本。对于治疗后的样本，先进行标准组织学处理和评估，确认有足够临床使用组织后，剩余部分用于研究。样本收集在生理盐水或 4% 缓冲福尔马林溶液中，用于后续处理和分析 。

（五）RNA 测序与分析

使用 RNeasy Mini Kit 提取总 RNA，确保 RNA 完整性数（RIN）为 10。利用 PolyA 选择协议构建文库，在 HiSeq 测序平台上进行测序，得到约 3.5 亿对末端测序读长。对测序数据进行质量控制、与人类基因组 GRCh38 比对、基因表达定量和差异表达分析。

（六）免疫印迹、免疫共沉淀、染色质免疫沉淀等实验

免疫印迹实验用于检测蛋白质表达水平；免疫共沉淀实验用于验证蛋白质之间的相互作用；染色质免疫沉淀（ChIP）实验则用于确定转录因子与基因启动子区域的结合情况。此外，还有免疫荧光、免疫组化、荧光素酶报告基因检测等实验技术，从不同层面探究分子机制 。

三、研究技术路线

研究人员首先通过单细胞 RNA 测序数据和 CytoTRACE 算法，分析 RASAL2 表达与 TNBC 细胞分化状态的关系。接着，利用患者匹配的肿瘤标本转录组数据，研究 RASAL2 在新辅助化疗前后的表达变化。在细胞水平，通过体外细胞毒性实验、细胞活力测定、凋亡相关蛋白检测等，探究 RASAL2 对化疗药物耐药性和细胞凋亡的影响。利用生物信息学工具预测转录因子，结合 ChIP-qPCR、荧光素酶报告基因检测等实验验证其对 RASAL2 和 BCL2 表达的调控作用。通过免疫荧光、共免疫沉淀、亚细胞分级分离等实验，研究 RASAL2 与 BCL2 的相互作用及亚细胞定位。最后，通过线粒体相关实验，如线粒体膜电位检测、细胞色素 c 释放检测等，探究 RASAL2 - BCL2 轴对线粒体功能和细胞凋亡的影响 。

四、研究结果

（一）治疗后残留的 TNBC 肿瘤中 RASAL2 相较于相邻正常乳腺组织富集

研究人员利用 CytoTRACE 算法分析单细胞 RNA 测序数据，发现高 RASAL2 表达与 TNBC 患者中分化程度较低的上皮细胞重叠，且与肿瘤转录组特征密切相关。对 TNBC 患者新辅助化疗前后的肿瘤标本分析显示，RASAL2 在治疗后的 TNBC 肿瘤中上调，且这种上调主要发生在肿瘤细胞中，在相邻正常组织中不明显。免疫组化和免疫印迹实验进一步证实了 RASAL2 蛋白在治疗后残留 TNBC 肿瘤组织中的富集。

（二）RASAL2 促进对铂类以外的细胞毒性药物的泛耐药

通过对公开的耐药模型进行计算分析和对人类癌细胞系的药物基因组学分析，研究人员发现 RASAL2 表达与对多种 DNA 损伤剂的耐药性相关，包括多柔比星、吉西他滨和 SN - 38 等 TNBC 常用化疗药物。体外细胞实验表明，过表达 RASAL2 可使 TNBC 细胞对这些药物更具抗性，而敲低 RASAL2 则可逆转耐药表型。在 TNBC 患者来源的异种移植（PDX）小鼠模型中，RASAL2 表达与化疗反应也显著相关。

（三）RASAL2 上调 BCL2

研究发现，化疗诱导的细胞凋亡在 RASAL2 过表达的 TNBC 细胞中明显减弱。基因集富集分析（GSEA）显示，RASAL2 过表达细胞中凋亡转录组特征下调。在 RASAL2 过表达的细胞中，抗凋亡基因（如 BCL2、BCL - XL 和 BAXI1）显著上调，而促凋亡基因（如 BIK、BIM 和 BOK）显著下调，其中 BCL2 上调最为明显。免疫印迹、定量免疫荧光等实验证实了 RASAL2 可上调 BCL2 蛋白水平。临床样本分析也显示，BCL2 与 RASAL2 在 mRNA 和蛋白水平呈正相关，且 RASAL2 通过激活 YAP 上调 BCL2 。

（四）CREB1 是驱动 BCL2 和 RASAL2 表达的共同转录因子

利用 JASPAR 和 LASAGNASearch 2.0 等生物信息学工具预测，结合患者肿瘤标本转录组数据分析，研究人员发现 CREB1 和 ZEB1 在治疗后的 TNBC 患者样本中上调，其中 CREB1 与 RASAL2 和 BCL2 的表达相关性更为显著。敲低 CREB1 可降低 RASAL2 和 BCL2 的 mRNA 和蛋白表达水平。ChIP - qPCR 实验证实 CREB1 可结合到 RASAL2 和 BCL2 的启动子区域，荧光素酶报告基因检测进一步表明 CREB1 对 RASAL2 转录起重要作用 。

（五）BCL2 与 RASAL2 在线粒体上相互作用

免疫荧光和高分辨率共聚焦显微镜观察显示，BCL2 与 RASAL2 在 TNBC 细胞和患者肿瘤中存在亚细胞共定位。AlphaFold 建模预测及免疫共沉淀实验证实了 BCL2 与 RASAL2 的 N 端存在相互作用。亚细胞分级分离实验表明，BCL2 主要定位于线粒体，RASAL2 则在细胞质和线粒体中均有分布，且线粒体标记实验进一步证实了两者在线粒体上的共定位 。

（六）高 BCL2 水平赋予线粒体对凋亡诱导的抗性

通过活细胞成像观察 GFP 标记的 BAX 在细胞中的积累情况，发现 RASAL2 缺失细胞中 BAX 积累速度更快。线粒体膜通透性转变孔（MOMP）实验显示，RASAL2 过表达细胞的线粒体在凋亡诱导后，细胞色素 c 释放减少。利用 JC - 1 染料检测线粒体膜电位，发现 RASAL2 过表达细胞在化疗药物处理后，JC - 1 聚集体（红色）更多，表明其线粒体对凋亡诱导的耐受性更高。敲低 CREB1 后，细胞对化疗药物的线粒体耐受性降低 。

五、研究结论与讨论

本研究揭示了 CREB1 - RASAL2 - BCL2 轴在介导三阴乳腺癌对多种 DNA 损伤剂耐药中的关键作用。RASAL2 在治疗后残留的 TNBC 肿瘤中富集，它不仅赋予肿瘤细胞对铂类药物的耐药性，还对其他常见 DNA 损伤细胞毒性药物产生耐药。RASAL2 通过激活 YAP 上调 BCL2 表达，CREB1 作为共同转录因子驱动 RASAL2 和 BCL2 的表达。BCL2 与 RASAL2 在线粒体上相互作用，高表达的 BCL2 增强了线粒体对去极化的抗性，减少细胞色素 c 释放，抑制促凋亡 BAX 的寡聚化，使肿瘤细胞能够抵抗化疗诱导的凋亡，从而导致化疗耐药。

该研究成果具有重要意义。一方面，它为三阴乳腺癌化疗耐药机制提供了新的见解，揭示了 RAS GAP 与凋亡调控之间的新联系，完善了对肿瘤细胞耐药机制的认识。另一方面，由于该调控轴中涉及多个可靶向的因子（如 RASAL2、BCL2、CREB1 等），为开发克服三阴乳腺癌化疗耐药的新策略提供了潜在的治疗靶点，有望推动三阴乳腺癌治疗领域的进一步发展，为改善 TNBC 患者的预后带来新的希望 。