全基因组基因表达谱在人源化小鼠中贯穿人疟疾寄生虫肝脏发育阶段

恶性疟原虫肝期寄生虫基因表达的转录组学揭示了转录调控、代谢途径和抗原表达，有助于疫苗和药物靶点的鉴定。

　　

解析恶性疟原虫肝期发育的基因表达谱：疟疾防治研究的新突破

西雅图儿童研究所全球传染病研究中心的 Gigliola Zanghí、Hardik Patel 等研究人员在Nature Microbiology期刊上发表了题为 “Genome-wide gene expression profiles throughout human malaria parasite liver stage development in humanized mice” 的论文。该研究通过对人源化小鼠体内恶性疟原虫（Plasmodium falciparum, Pf）肝期发育进行全基因组基因表达谱分析，为疟疾防治研究提供了关键数据，对开发新的疟疾疫苗和药物靶点意义重大。

研究背景

疟疾是一种严重的全球性公共卫生问题，由疟原虫感染引起，其中恶性疟原虫和间日疟原虫（Plasmodium vivax, Pv）对人类健康影响最大。尽管过去二十年疟疾防控取得了一定成效，但近年来疟疾发病率和死亡率有所回升，迫切需要基于疟原虫生物学的深入理解开发新的干预措施。

疟原虫的生活史复杂，其中肝期感染是无症状的，但却是疟疾疫苗开发和药物预防的重要靶点。肝期感染由子孢子侵入肝细胞开始，发育为肝期裂殖体后释放裂殖子，启动有症状的血液期感染。消除肝期感染可有效预防血液期感染和寄生虫传播。然而，目前获批的疟疾疫苗预防肝感染效果有限，而针对肝期的药物研发也进展缓慢，其中一个重要原因是恶性疟原虫肝期的基因表达情况尚未得到充分研究。此前的研究面临诸多技术挑战，如恶性疟原虫子孢子对原代人肝细胞具有高度特异性，在培养肝细胞中的感染率低，且在人肝癌细胞系中肝期发育异常等。

研究材料和方法

1. 实验动物和细胞：研究使用了 FRG NOD 小鼠，并将原代人肝细胞移植到该小鼠体内构建 FRG huHep 小鼠模型，该模型对恶性疟原虫和间日疟原虫子孢子高度易感，支持肝期的完整发育和向血液期的转变。同时，使用了恶性疟原虫 NF54 株，通过基因工程构建了表达绿色荧光蛋白（GFP）的 PfNF54CGFP 寄生虫株，用于感染肝细胞的分离和后续实验。
2. 实验方法
   • 构建荧光寄生虫株：利用疟原虫子孢子表面蛋白（CSP）基因的启动子驱动 GFP 在疟原虫红细胞外期的表达，构建 PfNF54CGFP 寄生虫株，并对其在整个寄生虫生命周期中的特性进行了全面表征。
   • 感染小鼠和细胞分选：将 PfNF54CGFP 子孢子注射到 FRG huHep 小鼠体内，在感染后的第 2、4、5、6 天，通过荧光激活细胞分选技术（FACS）分离感染的肝细胞（PfGFP+），并对分选细胞进行 RNA 测序文库构建和下一代测序（NGS）。
   • 数据分析：对测序数据进行质量控制、比对到定制参考基因组、归一化处理后，进行差异表达分析、聚类分析、蛋白质 - 蛋白质相互作用网络分析、基序富集分析等，以深入探究基因表达模式和调控机制。同时，构建了 PfLISP2 基因敲除寄生虫株，在 FRG huHep 小鼠中研究其对肝期发育的影响，并比较了恶性疟原虫和间日疟原虫肝期转录组的差异。
   
   

研究结果

1. PfGFP 寄生虫使感染肝细胞的分离成为可能：构建的 PfNF54CGFP 寄生虫在整个生命周期中表现出正常的无性血液期生长和配子体成熟，感染蚊子的能力与野生型 PfNF54 寄生虫相当。通过 FACS 从感染小鼠肝脏中成功分离出 PfGFP + 感染肝细胞，感染率平均为 0.1 - 0.15%，并通过活荧光显微镜确认了细胞纯度。
2. PfLS 寄生虫转录组
   • 转录组动态变化：对 23 个 PfGFP + 肝期 RNA 测序文库样本和 1 个 PfNF54CGFP 子孢子转录组进行分析，发现感染早期（第 2 天）主要检测到人类基因转录本，随着时间推移，Pf 转录本比例增加，第 6 天达到最高。通过差异表达分析，发现早期（第 2 天）和中期（第 4 天）肝期发育中，大多数差异表达基因（DEGs）表达量降低，而晚期（第 5 天和第 6 天）表达量增加的转录本比例上升。
   • 基因功能富集分析：对第 2 天肝期滋养体与子孢子的差异表达基因进行基因本体（GO）富集分析，发现肝期滋养体中表达量降低的基因主要参与子孢子运动和细胞侵袭等途径，而表达量增加的基因富集在翻译调控和核糖体生物发生等途径。此外，第 2 天与调节宿主细胞相关的基因上调，包括两类克隆变异基因家族成员和一些编码定位于质体的蛋白的基因。对中期（第 4 天）和晚期（第 5 天和第 6 天）肝期进行时间进程基因表达分析，鉴定出 1510 个与肝期发育时间变化显著相关的基因，并将其分为 9 个独特的转录簇，进一步归类为 5 个主要转录谱，每个转录谱都与特定的生物学过程相关。
   • 蛋白质 - 蛋白质相互作用网络分析：整合蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）网络和肝期基因表达数据，鉴定出不同转录谱中的功能 PPI 模块。例如，转录谱 I 模块中蛋白酶解蛋白和内膜复合物表达下调；转录谱 III 模块中翻译 / 核糖体和免疫蛋白酶体相关蛋白富集。
   
   
3. 肝期发育过程中的转录调控：研究人员评估了 ApiAP2 转录因子家族在肝期发育过程中的表达模式，并将其与共表达簇内基因的富集 DNA 靶基序相关联。发现感染第 2 天，调节红细胞入侵的 ApiAP2 因子基序在上调基因中显著富集，而在配子体和蚊子阶段起作用的 ApiAP2 成员在下调基因中过度表达。此外，还鉴定出一些未表征的 ApiAP2 成员在肝期发育过程中富集，暗示它们在肝期感染中可能发挥重要作用。通过 OrthoMCL 分析，研究人员还发现了一些不属于 ApiAP2 家族的新型转录因子结合基序和转录因子，它们与特定的转录簇呈负相关。
4. PfLS 中 PTEX、PEXEL 和 PNEP 的表达：研究发现 PfLS 在转录和蛋白质水平上均表达蛋白质输出机制 PTEX 的所有组件，包括 EXP2、PTEX150 和 HSP101 等。通过对 PfLS 转录组的生物信息学挖掘，发现约 19% 的编码 PEXEL 蛋白的基因和 32% 的编码 PNEP 蛋白的基因在肝期发育过程中转录，且不同基因的表达在不同时间点达到峰值。此外，还鉴定出 589 个编码 “分泌 + PEXEL 样基序”（PLM）蛋白的基因，约 60% 在 PfLS 发育过程中有转录本。
5. PfLISP2 基因敲除寄生虫在 FRG huHep 小鼠中的特征：对 PfLISP2 在不同肝期发育时间点的表达和定位进行分析，发现其蛋白表达与转录表达一致，从感染第 2 天开始可检测到，第 4 天和第 6 天表达增强，定位与 CSP 相似。构建 PfLISP2 基因敲除寄生虫株（Pflisp2?）后发现，该敲除株在血液期和蚊子阶段发育正常，但在肝期，第 6 天和第 7 天的 Pflisp2?肝期虫体明显小于野生型，且部分感染 Pflisp2?子孢子的小鼠无法完成肝期到血液期的转变，表明 PfLISP2 在肝期晚期生长中起重要作用。
6. Pf 和 Pv 肝期转录组的保守性和差异：比较晚期 Pf 和 Pv 肝期裂殖体的转录组，发现两种疟原虫有大量的基因表达重叠，共表达基因主要富集在与寄生虫发育相关的途径，如线粒体靶向基因产物和蛋白质转运相关基因产物等。在 Pf 肝期表达但无 Pv 同源物的基因中，发现多个克隆变异基因家族成员的表达，包括 var 基因，且在成熟 Pf 肝期裂殖体中检测到 PfEMP1 蛋白表达。在 Pv 肝期基因中，鉴定出多个 pir 和 vir 克隆变异基因家族成员的转录本。此外，研究发现 Pv 肝期裂殖体中存在性阶段特异性蛋白和 AP2 - g 转录因子的转录本，而 Pf 肝期转录组中未检测到 AP2 - g 的表达，进一步实验证实 Pf 肝期寄生虫不会直接产生性阶段后代，必须在血液中经历至少一个完整的无性繁殖周期才会发生性分化。

研究结论和讨论

本研究成功对恶性疟原虫肝期的基因表达进行了全面分析，揭示了驱动肝期发育的关键基因和途径。研究发现子孢子感染肝细胞后，子孢子的翻译抑制机制下调，这对其向细胞内滋养体的转变和在肝细胞内的定植至关重要。肝期发育过程中，脂肪酸和类异戊二烯生物合成代谢途径在早期富集，后期氨基酸合成和众多代谢途径上调，同时参与氧化还原稳态的基因产物也上调，以应对感染肝细胞产生的氧化应激。

通过分析转录因子 DNA 结合基序富集，发现了一些未表征的 ApiAP2 转录因子与肝期晚期发育相关基因的联系，以及在灵长类疟疾寄生虫中特异性上调的 ApiAP2 成员，为进一步研究肝期感染的调控机制提供了线索。研究还证实了 PfLS 中存在蛋白质输出机制 PTEX，预测了肝期输出蛋白组，并通过基因敲除实验表明 PfLISP2 在肝期生长中起重要作用，尽管目前尚未明确其是否真正输出到肝期外。此外，研究首次发现恶性疟原虫和间日疟原虫在肝期性分化方面的差异，这对理解疟疾传播动力学具有重要意义。

然而，本研究也存在一定的局限性。研究是在缺乏功能性免疫系统的 FRG huHep 小鼠中进行的，无法评估人类宿主反应对肝期寄生虫转录组谱的影响。此外，研究测量的是混合分离的肝期寄生虫的转录丰度，未来需要进行单细胞研究以揭示肝期发育过程中寄生虫的异质性。同时，对于预测的输出蛋白，需要进一步实验验证其是否真正输出到感染的肝细胞中，以及确定 PfEMP1 变异蛋白在肝期的潜在功能。

尽管如此，本研究的数据为肝期疟疾研究提供了丰富的资源，有助于推动疟疾疫苗和药物靶点的鉴定和开发，为预防和控制疟疾感染提供了新的理论基础和研究方向。