解析 Akkermansia muciniphila 降解黏蛋白 O - 聚糖的分子机制:肠道微生物与宿主相互作用研究新进展
来自英国伯明翰大学医学院和健康学院感染、炎症与免疫学学院微生物、感染和微生物组系的研究人员 Cassie R. Bakshani、Taiwo O. Ojuri 等人,在《Nature Microbiology》期刊上发表了题为 “Carbohydrate-active enzymes from Akkermansia muciniphila break down mucin O-glycans to completion” 的论文。该研究首次系统性地对 Akkermansia muciniphila(A. muciniphila)中的碳水化合物活性酶进行了全面的生化表征,这一成果对于深入理解肠道微生物与宿主之间的相互作用机制、探究肠道微生物在健康和疾病中的作用具有重要意义,为后续开发基于肠道微生物的诊断和治疗方法提供了关键的理论基础 。
A. muciniphila 是一种栖息在人体大肠黏膜层的微生物共生体,其主要碳源是高度异质的黏蛋白糖蛋白,它利用一系列碳水化合物活性酶和硫酸酯酶来获取这一复杂的能量来源。此前虽对 A. muciniphila 的部分碳水化合物活性酶和糖肽酶进行了研究,但尚未有针对任何细菌物种的黏蛋白降解的系统研究,A. muciniphila 中仍有许多酶未被表征。因此,全面了解 A. muciniphila 如何降解黏蛋白 O - 聚糖及相关结构,对于深入认识肠道微生物与宿主的相互作用至关重要。
研究材料与方法
实验菌株与培养条件
研究使用 A. muciniphila ATCC BAA - 835 菌株,在切碎肉汁肉汤(CMB)中厌氧培养。通过在不同培养基中添加各种潜在的营养源,如多种糖蛋白、多糖、寡糖等,观察其生长情况,监测生长曲线。
利用 SignalP 6.0 预测信号序列,Clustal Omega 进行序列比对确定序列同一性,CAZy 数据库对碳水化合物活性酶进行分类,SeaView 和 Interactive Tree of Life 构建系统发育树,分析不同酶在不同物种和菌株中的分布及保守性。
研究技术路线
研究人员首先通过 RNA 测序,分析 A. muciniphila 在以 PGMIII 为营养源时基因表达的变化,筛选出上调的碳水化合物活性酶基因。然后表达并纯化这些酶,利用全细胞分析和重组酶分析,结合多种检测技术,如 TLC、HPAEC - PAD、LC - FLD - ESI - MS 等,研究酶对不同底物的活性和特异性。通过一系列实验,确定酶在降解黏蛋白 O - 聚糖过程中的作用顺序和协同机制,构建 A. muciniphila 降解黏蛋白的模型。
研究结果
AM 碳水化合物活性酶可将 PGMIII 中的 O - 聚糖降解至核心 GalNAc
在 A. muciniphila 基因组中编码了两种假定的 GH31 酶,其中 Amuc_1008^{GH31} 属于亚家族 18,通过系统发育树分析发现其与其他已表征的 GH31_18 酶聚类。实验表明,Amuc_1008^{GH31} 对与肽相连的核心 α - GalNAc 具有特异性,在测试的所有酶中,它释放的 GalNAc 浓度最高,但不能水解 Tn 抗原,且需要多个氨基酸才能发挥活性。在全细胞分析中,该酶对 BSM 中的 GalNAc 去除不明显,支持其位于周质空间的预测。当使用 AM 酶混合物时,Amuc_1008^{GH31} 能够从 PGMIII 中释放 GalNAc,表明 AM 酶能够将 O - 聚糖完全降解至多肽。
通过上调数据和 SulfAtlas 数据库,确定了 A. muciniphila 基因组中的 12 种潜在硫酸酯酶。这些酶可分为七个不同家族和一个未知家族(最终发现不是硫酸酯酶)。对定义的硫酸化底物进行筛选,发现不同的硫酸酯酶对不同的硫酸化单糖有活性。利用硫酸酯酶、α - 岩藻糖苷酶和 β - 半乳糖苷酶的组合,研究不同硫酸化 Lewis 结构的分解方式,发现 3'S 和 6S - Lewis A 和 X 聚糖的分解途径不同,且未能找到分解 6'S - Lewis 结构的方法。
AM 与 GAGs、N - 糖蛋白和淀粉的相互作用
研究发现 A. muciniphila 不能直接在测试的任何糖胺聚糖(GAGs)上生长,但其基因组编码的 Amuc_0778^{PL38} 和 Amuc_0863 对除硫酸乙酰肝素外的所有 GAGs 都有活性。A. muciniphila 能够在高甘露糖 N - 糖蛋白上生长,分析发现其利用的是蛋白质成分,而留下聚糖。此外,研究中还有 11 种假定的碳水化合物活性酶和 3 种硫酸酯酶未检测到活性。
研究结论与讨论
本研究系统地对 A. muciniphila 中的碳水化合物活性酶进行了全面的生化表征,详细阐述了其降解黏蛋白 O - 聚糖及相关结构的机制。研究结果揭示了 A. muciniphila 如何适应获取哺乳动物来源的聚糖,确定了不同酶对不同底物的作用顺序,展示了复杂底物的顺序分解过程,并证明了 AM 碳水化合物活性酶混合物可将复杂黏蛋白底物降解至核心 GalNAc,提出了 A. muciniphila 降解黏蛋白的模型。
然而,该研究存在一定的局限性。由于人黏蛋白难以获取,研究使用了猪胃黏蛋白,未来应利用人源黏蛋白进行进一步研究。此外,本研究是在体外单独分析 A. muciniphila,未考虑微生物群落和宿主环境的影响,后续研究需在更接近自然环境的条件下深入探究这些酶的作用。尽管如此,本研究为深入理解肠道微生物与宿主之间的相互作用提供了重要的理论依据,有助于进一步探究肠道微生物在健康和疾病中的作用机制。研究中鉴定的酶可为研究不同黏蛋白结构提供新的工具,在监测健康和疾病组织中黏蛋白 O - 聚糖的变化、检测疾病相关表位等方面具有潜在的应用价值,有望推动基于肠道微生物的诊断和治疗方法的开发。