来自嗜粘菌的碳水化合物活性酶将粘蛋白o -聚糖分解完成

来自肠道微生物嗜粘菌Akkermansia muciniphila的66种糖活性酶的生化表征表明，这些酶可以分解一系列宿主聚糖，包括粘蛋白，并将其降解至完全。

　　

解析 Akkermansia muciniphila 降解黏蛋白 O - 聚糖的分子机制：肠道微生物与宿主相互作用研究新进展

来自英国伯明翰大学医学院和健康学院感染、炎症与免疫学学院微生物、感染和微生物组系的研究人员 Cassie R. Bakshani、Taiwo O. Ojuri 等人，在《Nature Microbiology》期刊上发表了题为 “Carbohydrate-active enzymes from Akkermansia muciniphila break down mucin O-glycans to completion” 的论文。该研究首次系统性地对 Akkermansia muciniphila（A. muciniphila）中的碳水化合物活性酶进行了全面的生化表征，这一成果对于深入理解肠道微生物与宿主之间的相互作用机制、探究肠道微生物在健康和疾病中的作用具有重要意义，为后续开发基于肠道微生物的诊断和治疗方法提供了关键的理论基础 。

研究背景

人体肠道微生物群在健康和疾病中发挥着至关重要的作用，其与宿主之间的相互作用复杂多样，其中黏蛋白的分解是微生物 - 宿主界面上的一个关键过程。人体大肠黏膜表面主要由分泌型黏蛋白构成，这种糖蛋白中约 80%（干重）是 O - 聚糖。O - 聚糖结构具有高度的异质性，其由仅有的五种单糖组成，但单糖之间的连接方式和硫酸化模式多样。在健康状态下，黏蛋白的产生和分解处于平衡状态，然而结肠疾病状态时，黏膜层被破坏，黏蛋白分解细菌的比例发生变化。例如，A. muciniphila 在人体中的流行率与疾病和炎症标志物呈负相关，而 Ruminococcus gnavus 则相反，在疾病状态下其数量增加。据估计，约 60% 的人类肠道微生物群可以利用黏蛋白作为营养来源，但这一过程及其与疾病的关联尚未完全明晰。

A. muciniphila 是一种栖息在人体大肠黏膜层的微生物共生体，其主要碳源是高度异质的黏蛋白糖蛋白，它利用一系列碳水化合物活性酶和硫酸酯酶来获取这一复杂的能量来源。此前虽对 A. muciniphila 的部分碳水化合物活性酶和糖肽酶进行了研究，但尚未有针对任何细菌物种的黏蛋白降解的系统研究，A. muciniphila 中仍有许多酶未被表征。因此，全面了解 A. muciniphila 如何降解黏蛋白 O - 聚糖及相关结构，对于深入认识肠道微生物与宿主的相互作用至关重要。

研究材料与方法

实验菌株与培养条件

研究使用 A. muciniphila ATCC BAA - 835 菌株，在切碎肉汁肉汤（CMB）中厌氧培养。通过在不同培养基中添加各种潜在的营养源，如多种糖蛋白、多糖、寡糖等，观察其生长情况，监测生长曲线。

底物准备

研究中使用的底物来源广泛，包括猪胃黏蛋白 III（PGMIII）、牛颌下黏蛋白（BSM）、透明质酸、硫酸软骨素等多种糖蛋白、多糖和寡糖。PGMIII 需溶解过夜后离心去除沉淀，其他底物也按相应方法处理。

重组蛋白表达与纯化

将重组质粒转化到 Tuner 细胞中，在含有相应抗生素的培养基中培养。待细胞生长至对数中期，降温并添加异丙基 β - D - 硫代半乳糖苷诱导蛋白表达。利用固定化金属亲和层析法纯化带有 His 标签的重组蛋白，通过十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳评估纯化效果，最后使用离心浓缩器浓缩蛋白并测定浓度。

全细胞分析

从甘油冻存管中接种过夜起始培养物，培养后收集细胞，洗涤并调整浓度。将细胞与底物按 50:50 的比例混合进行全细胞分析，反应终止后进行后续检测。通过薄层层析（TLC）初步分析反应产物，再利用液相色谱 - 荧光检测 - 电喷雾 - 质谱（LC - FLD - ESI - MS）对释放的聚糖片段进行详细表征。

酶活性分析

利用高效阴离子交换色谱 - 脉冲安培检测（HPAEC - PAD）分析单糖释放情况，以此确定酶对不同底物的活性。在不同条件下对重组酶进行活性检测，如改变底物浓度、反应时间等，评估酶的催化能力和底物特异性。对于硫酸酯酶，还需添加氯化钙进行检测。

生物信息学分析

利用 SignalP 6.0 预测信号序列，Clustal Omega 进行序列比对确定序列同一性，CAZy 数据库对碳水化合物活性酶进行分类，SeaView 和 Interactive Tree of Life 构建系统发育树，分析不同酶在不同物种和菌株中的分布及保守性。

研究技术路线

研究人员首先通过 RNA 测序，分析 A. muciniphila 在以 PGMIII 为营养源时基因表达的变化，筛选出上调的碳水化合物活性酶基因。然后表达并纯化这些酶，利用全细胞分析和重组酶分析，结合多种检测技术，如 TLC、HPAEC - PAD、LC - FLD - ESI - MS 等，研究酶对不同底物的活性和特异性。通过一系列实验，确定酶在降解黏蛋白 O - 聚糖过程中的作用顺序和协同机制，构建 A. muciniphila 降解黏蛋白的模型。

研究结果

AM 碳水化合物活性酶可将 PGMIII 中的 O - 聚糖降解至核心 GalNAc

在 A. muciniphila 基因组中编码了两种假定的 GH31 酶，其中 Amuc_1008^{GH31} 属于亚家族 18，通过系统发育树分析发现其与其他已表征的 GH31_18 酶聚类。实验表明，Amuc_1008^{GH31} 对与肽相连的核心 α - GalNAc 具有特异性，在测试的所有酶中，它释放的 GalNAc 浓度最高，但不能水解 Tn 抗原，且需要多个氨基酸才能发挥活性。在全细胞分析中，该酶对 BSM 中的 GalNAc 去除不明显，支持其位于周质空间的预测。当使用 AM 酶混合物时，Amuc_1008^{GH31} 能够从 PGMIII 中释放 GalNAc，表明 AM 酶能够将 O - 聚糖完全降解至多肽。

AM 体内研究

A. muciniphila 的底物利用范围较窄，主要碳源为黏蛋白，实验结果与此前观察一致。对 PGMIII 培养的 A. muciniphila 进行 RNA 测序，发现 20 种碳水化合物活性酶（来自糖苷水解酶（GH）家族 2、16、20、27、29、36、89、95、97、105、109 和 123）和 4 种硫酸酯酶编码基因上调。全细胞分析显示，A. muciniphila 表面的酶可产生一系列黏蛋白 O - 聚糖片段，半乳糖通常存在于还原端，表明存在 GH16 内切 O - 聚糖酶活性。此外，利用 PGMIII 培养的细胞对多种定义的寡糖进行全细胞分析，发现对 TriLacNAc、人乳寡糖（HMOs）、Forssman 抗原（FORS1）和乳糖 - N - 双糖有活性，对 BSM 的全细胞分析仅显示释放唾液酸。

从 PGMIII O - 聚糖中水解 α - 连接的半乳糖

A. muciniphila 基因组编码两种假定的 GH110 酶（Amuc_0480^{GH110} 和 Amuc_1463^{GH110}），它们对血型 B（BGB）I 型和 II 型以及 α1,3 - 连接的半乳糖有活性，是 AM 中仅有的对 BGB 有活性的酶。一种假定的 GH27 酶（Amuc_1187^{GH27}）对大多数测试底物非还原端的 α - 连接半乳糖有活性，但对 BG 结构无活性。此外，基因组中编码的三种假定的 GH36 酶和一种假定的 GH97 酶也能从 PGMIII 中去除半乳糖，尽管量相对较少。

从 PGMIII O - 聚糖中水解 α - 连接的 GalNAc

具有针对 α - GalNAc 封端结构活性的 AM 酶来自 GH36 和 GH109 家族。其中 Amuc_0216^{GH36} 能够作用于所有测试的带有 α - GalNAc 修饰的底物，且是唯一能降解 Tn 抗原的酶；Amuc_0517^{GH36} 仅对 BGA 有特异性。两种假定的 GH109 酶（Amuc_0017^{GH109} 和 Amuc_0920）对 α - GalNAc 底物具有特异性，但不包括 Tn 抗原。使用 HPAEC - PAD 证实，这两种 GH36 酶在有或没有唾液酸酶和岩藻糖苷酶预处理的情况下，都能从 PGMIII 中释放相对大量的 GalNAc。

从 PGMIII O - 聚糖中水解 α - 连接的 GlcNAc

A. muciniphila 基因组编码两种假定的 GH89 酶（Amuc_0060 和 Amuc_1220^{GH89}），它们仅对 GlcNAcα1,4 - Gal 二糖有活性，但 Amuc_0060 不能在过夜反应中完全水解该底物。Amuc_1220^{GH89} 能够从 PGMIII 中去除相对大量的 GlcNAc，通过 HPAEC - PAD 得以证实。

水解 PGMIII O - 聚糖中的唾液酸和岩藻糖

A. muciniphila 拥有三种唾液酸酶和六种岩藻糖苷酶，此前已对它们的特异性进行了深入表征。在本研究中进一步发现，两种 GH33 酶可作用于相对复杂的 GD1a 和 GT1b 神经节苷脂结构以及 Sda 抗原；Amuc_0010^{GH29} 对 2 型 BG 结构和乳糖 - N - 新四糖 HMO 系列有特异性，Amuc_1120^{GH95} 可从 1 型和 2 型结构中水解岩藻糖。例如，只有 Amuc_1120 能从未处理的 PGMIII 中水解岩藻糖，表明该底物在 O - 聚糖非还原端仅具有 1 型结构可供岩藻糖苷酶作用。

内切和外切碳水化合物活性酶的组合

通过一系列顺序反应，结合 LC - FLD - ESI - MS 分析，研究发现 Amuc_1220^{GH89}、Amuc_0216^{GH36} 和 Amuc_0517^{GH36} 能够作用于 GH16 产生的 O - 聚糖片段，从而对 GH16 产生的片段进行表征。同时观察到四种岩藻糖苷酶作用于 GH16 产生的 10 号 O - 聚糖片段，不同的岩藻糖苷酶作用于不同结构的 10 号聚糖，进一步证实了它们的底物特异性。

研究 β - 半乳糖苷酶活性

A. muciniphila 基因组编码九种可能的 β - 半乳糖苷酶，来自 GH2、GH35 和 GH43 亚家族 24。重组酶筛选结果显示，这些 β - 半乳糖苷酶具有不同的底物特异性，它们能够分解所有测试的定义寡糖。测试这些 β - 半乳糖苷酶对经不同 AM 碳水化合物活性酶顺序处理的 PGMIII 的活性，发现经去除 α - 连接的 GlcNAc 和 GalNAc 的酶以及一种岩藻糖苷酶预处理后，部分 β - 半乳糖苷酶能够从 PGMIII 中释放半乳糖。此外，GH2 和 GH35 酶对乳糖基神经酰胺（神经节苷脂和球蛋白核心结构）也有活性。

研究 β - HexNAc 活性

GH20 家族是 A. muciniphila 中最大的家族，编码 11 种假定的酶，主要表现为外切 β - GlcNAcases 活性，也有对 GalNAc 的活性。研究发现这些 β - HexNAcases 对黏蛋白中发现的聚糖结构具有特异性，能够作用于所有提供的定义底物。对经顺序处理的 PGMIII 进行测试，发现部分 β - HexNAcases 能够分解硫酸化的二糖。此外，利用 AM 碳水化合物活性酶从神经节苷脂 GD1a 制备 Sda 抗原，发现只有 Amuc_1924^{GH20} 能够在终点反应中容纳分支唾液酸，从而作用于 Sda 抗原中的 GalNAc。

处理硫酸化底物

通过上调数据和 SulfAtlas 数据库，确定了 A. muciniphila 基因组中的 12 种潜在硫酸酯酶。这些酶可分为七个不同家族和一个未知家族（最终发现不是硫酸酯酶）。对定义的硫酸化底物进行筛选，发现不同的硫酸酯酶对不同的硫酸化单糖有活性。利用硫酸酯酶、α - 岩藻糖苷酶和 β - 半乳糖苷酶的组合，研究不同硫酸化 Lewis 结构的分解方式，发现 3'S 和 6S - Lewis A 和 X 聚糖的分解途径不同，且未能找到分解 6'S - Lewis 结构的方法。

AM 与 GAGs、N - 糖蛋白和淀粉的相互作用

研究发现 A. muciniphila 不能直接在测试的任何糖胺聚糖（GAGs）上生长，但其基因组编码的 Amuc_0778^{PL38} 和 Amuc_0863 对除硫酸乙酰肝素外的所有 GAGs 都有活性。A. muciniphila 能够在高甘露糖 N - 糖蛋白上生长，分析发现其利用的是蛋白质成分，而留下聚糖。此外，研究中还有 11 种假定的碳水化合物活性酶和 3 种硫酸酯酶未检测到活性。

研究结论与讨论

本研究系统地对 A. muciniphila 中的碳水化合物活性酶进行了全面的生化表征，详细阐述了其降解黏蛋白 O - 聚糖及相关结构的机制。研究结果揭示了 A. muciniphila 如何适应获取哺乳动物来源的聚糖，确定了不同酶对不同底物的作用顺序，展示了复杂底物的顺序分解过程，并证明了 AM 碳水化合物活性酶混合物可将复杂黏蛋白底物降解至核心 GalNAc，提出了 A. muciniphila 降解黏蛋白的模型。

然而，该研究存在一定的局限性。由于人黏蛋白难以获取，研究使用了猪胃黏蛋白，未来应利用人源黏蛋白进行进一步研究。此外，本研究是在体外单独分析 A. muciniphila，未考虑微生物群落和宿主环境的影响，后续研究需在更接近自然环境的条件下深入探究这些酶的作用。尽管如此，本研究为深入理解肠道微生物与宿主之间的相互作用提供了重要的理论依据，有助于进一步探究肠道微生物在健康和疾病中的作用机制。研究中鉴定的酶可为研究不同黏蛋白结构提供新的工具，在监测健康和疾病组织中黏蛋白 O - 聚糖的变化、检测疾病相关表位等方面具有潜在的应用价值，有望推动基于肠道微生物的诊断和治疗方法的开发。