人类淋巴组织的时间谱揭示了对病毒挑战的协调防御

Clatworthy及其同事研究了成人鼻淋巴组织对SARS-CoV-2感染的反应。纵向分析揭示了阻断病毒进入上皮细胞层的屏障组织的变化，以及病毒感染后组织如何进行修复。

　　

解析人类淋巴组织在病毒挑战下的免疫应答机制 —— 剑桥大学研究成果解读

近期，来自剑桥大学分子免疫学部等多个单位的研究人员在《Nature Immunology》杂志上发表了题为 “Temporal profiling of human lymphoid tissues reveals coordinated defense against viral challenge” 的论文。该研究意义重大，为深入理解人类鼻腔适应性免疫应答在病毒挑战下的产生与维持机制提供了独特视角，也为研究淋巴组织在疾病和治疗干预后的变化奠定了基础。

一、研究背景

适应性免疫在淋巴器官中产生，但人体淋巴组织在感染期间的自我防御机制尚不明确。鼻上皮是病毒进入的主要部位，腺样体鼻相关淋巴组织（NALT）可产生早期适应性免疫反应。以往对人类淋巴组织感染的研究受限，部分原因是人体采样困难。虽然动物模型对淋巴组织防御机制的研究有一定进展，如小鼠的亚包膜窦巨噬细胞在淋巴结防御中起重要作用，但这些结果不能直接类推到人类。此外，新冠病毒（SARS-CoV-2）虽已被广泛研究，但多采用外周血或上皮采样，无法捕获淋巴滤泡成分，如生发中心 B 细胞。因此，探究人类 NALT 在病毒感染时的免疫应答机制迫在眉睫。

二、研究材料与方法

（一）研究对象

研究人员从英国剑桥的 Addenbrooke’s 医院招募了 COVID-19 患者和健康对照者。COVID-19 患者包括急性感染期（首次 SARS-CoV-2 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测阳性后 1 周内采样）和康复期（首次阳性 RT-PCR 检测后 3 - 5 周采样，临床无症状）的患者，健康对照者在 2019 年 8 月至 11 月招募。所有参与者均提供了知情同意书，排除了年龄小于 18 岁、患有慢性系统性感染、恶性肿瘤、接受过头颈部放疗、患有系统性自身免疫性疾病或存在鼻腔或鼻后异常影响采样的个体。

（二）样本采集

在局部麻醉下，由耳鼻喉科医生通过内镜采集鼻腔样本，包括鼻刷、微刮匙样本和 PNS 活检样本，并同时采集外周血样本。样本采集后迅速处理，在 1 小时内进行后续实验。

（三）关键技术路线

1. 单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）：将 PNS 样本与刮匙和刷取细胞按 2:1:1 比例混合（若刮匙和刷取细胞数量不足，则仅用 PNS 样本），与外周血样本一同稀释后加载到 10x Chromium 控制器上，创建单细胞文库和 TCR、BCR VDJ 文库，使用 Novaseq 6000 S4 系统测序。
2. 多参数流式细胞术：scRNA-seq GEM 创建后，将剩余单细胞悬液稀释，用 FcR 阻断试剂阻断后进行表面染色，使用 Fortessa II 流式细胞仪检测，用 FlowJo 软件分析数据。
3. 共聚焦成像：PNS 活检样本固定、蔗糖处理后包埋在 OCT 中，切片后进行通透、阻断和染色，使用 TCS SP8 倒置显微镜成像，用 Imaris 软件处理图像。

三、研究结果

（一）鼻后空间活检可用于淋巴组织分析

研究人员开发了一种耐受性良好的内镜技术采集 NALT 活检样本。对 23 名参与者（10 名健康对照、8 名急性 COVID-19 患者、5 名康复期 COVID-19 患者）的样本进行分析，通过质量控制后获得 162,738 个细胞的数据。结果显示，鼻腔样本中 GC B 细胞和 细胞显著富集，且康复期 NALT 样本中 GC B 细胞尤为丰富。NALT 样本与成人鼻腔和支气管刷取样本不同，后者 细胞和 GC B 细胞稀少。共聚焦成像证实 NALT 活检样本存在 B 细胞滤泡和 T 细胞富集区域。此外，COVID-19 样本中 NALT 的差异表达基因数量多于血液，基因集富集分析（GSEA）显示 NALT 中富集的基因集数量、幅度和显著性均高于外周血。这表明鼻后空间活检可用于分析成人功能性淋巴组织，捕获血液或鼻腔刷取样本中不存在的滤泡细胞类型。

（二）MNPs 有助于淋巴组织的防御和修复

研究人员在单核吞噬细胞（MNPs）中鉴定出 11 种细胞类型。急性 COVID-19 患者中，经典单核细胞在鼻腔组织和外周血中的比例增加，且这些单核细胞表达多种趋化因子和抗菌肽。共聚焦成像显示，CD14 单核细胞在急性感染期主要位于上皮下，在康复期包围部分 B 细胞滤泡，与中性粒细胞共同形成防御屏障。此外，FOLR2 + 巨噬细胞在康复期 COVID-19 患者的 NALT 中显著增加，主要位于 T 细胞区，且其转录程序在急性和康复期发生变化，参与组织修复。GSEA 显示，鼻腔细胞类型的 IFNα 和 IFNγ 反应基因富集程度高于循环细胞，且巨噬细胞在康复期的上皮 - 间质转化（EMT）基因集富集增加，表明其在组织稳态恢复中起作用。

（三）克隆扩增的 NALT CD8 细胞表现出持续激活

研究人员对 T 细胞、自然杀伤（NK）细胞和固有样淋巴细胞进行分析，鉴定出 19 种细胞类型。发现 CD4 T 细胞在鼻腔样本中富集，组织驻留记忆（）CD8 T 细胞、 细胞和 ILCs 几乎仅在 NALT 样本中存在。在 COVID-19 患者中，NALT CD8 T 细胞数量增加，尤其是幼稚、中央记忆和 细胞。 细胞在康复期表现出克隆扩增和持续的细胞毒性活性，且转录上的耗竭迹象较少。单细胞 T 细胞受体（TCR）分析显示，康复期鼻腔 CD8 细胞的多样性最低，表明其发生了克隆扩增。此外，通过与数据库匹配，发现康复期 NALT CD8 细胞中病毒特异性 CD8 T 细胞增加。

（四）SARS-CoV-2 感染中的抗病毒 GC 反应

在 B 细胞区室中，研究人员鉴定出多种 B 细胞亚群，包括幼稚 B 细胞、记忆 B 细胞、浆细胞等。鼻腔 B 细胞区室在急性和康复期 COVID-19 患者中均扩张，康复期 GC 群体显著增加。共聚焦成像显示，浆细胞在康复期沿上皮下分布，且 NALT 上皮细胞中多聚免疫球蛋白受体（PIGR）表达增加，有助于 IgA 转运。GC B 细胞在急性 COVID-19 患者中表达多种 I 型干扰素依赖性抗病毒基因，BCR 分析显示康复期 GC B 细胞的 V (D) J 重排和选择增加。通过与参考数据库匹配，发现康复期 GC B 细胞中 SARS-CoV-2 特异性 BCR 序列增加，表明 NALT 可产生早期局部抗病毒抗体。此外，研究人员还发现 I 型干扰素可能抑制 GC 反应的进展，影响 GC B 细胞的命运决定。

四、研究结论与讨论

（一）研究结论

1. 研究证实成人鼻后空间含有对病毒感染有反应的淋巴组织，NALT 活检可在门诊收集，为纵向评估人类次级淋巴组织提供了方法。
2. 揭示了 NALT 在 SARS-CoV-2 感染过程中的免疫应答机制，包括单核细胞和中性粒细胞形成防御屏障、巨噬细胞参与组织修复、CD8 细胞克隆扩增和持续激活、B 细胞区室的变化以及抗病毒 GC 反应等。
3. 发现 I 型干扰素在 GC 反应中的作用，其可能抑制 GC 反应进展，影响 B 细胞命运决定，为解释严重 COVID-19 患者中有限的 GC 形成提供了线索。

（二）讨论

1. 研究的重要意义：该研究为理解人类鼻腔适应性免疫应答在病毒挑战下的机制提供了关键信息，对研究通过鼻腔感染的病原体和鼻腔疫苗具有重要意义。同时，证明了 NALT 活检可用于研究参与适应性免疫但不在血液中的细胞类型，为进一步研究淋巴器官在疾病和治疗干预后的变化提供了依据。
2. 研究的局限性：急性和康复期样本并非来自同一参与者，且部分急性 COVID-19 患者使用了可能影响免疫反应的药物，这可能影响急性和康复期的比较结果。此外，研究未采集鼻腔分泌物或唾液样本直接测量 Ig 水平。
3. 未来研究方向：未来研究可进一步探究不同病原体感染时 NALT 的免疫应答差异，以及免疫调节药物对 NALT 免疫反应的影响。同时，可深入研究 I 型干扰素在 GC 反应中的具体作用机制，为开发针对 COVID-19 和其他病毒感染的治疗策略提供理论基础。

综上所述，该研究通过对 NALT 的深入分析，揭示了人类淋巴组织在 SARS-CoV-2 感染下的免疫应答机制，为理解适应性免疫和开发相关治疗方法提供了重要参考。尽管存在局限性，但为后续研究指明了方向，具有重要的科学价值和临床意义。