细胞通过微管依赖的机械转导在液膜上粘附和扩散

在细胞粘附过程中，整合素通常被认为需要固定化配体来扩散。在这里，作者证明细胞可以通过与高亲和力的入侵蛋白配体相互作用在流体底物上扩散并形成成熟的整合素粘附。

　　

微管介导的机械转导：细胞在流体膜上的黏附和铺展新机制

近日，来自居里研究所（Institut Curie）等单位的研究人员在《Nature Communications》期刊上发表了题为 “Cell adhesion and spreading on fluid membranes through microtubules-dependent mechanotransduction” 的论文。该研究揭示了细胞在流体膜上黏附和铺展的新机制，为理解细胞与细胞外基质的相互作用提供了重要依据，对生物医学领域研究细胞行为、组织发育以及疾病发生发展过程中的细胞黏附机制具有重要意义。

一、研究背景

整合素介导的细胞黏附在细胞迁移、分化以及组织和器官发育等基本细胞过程中起着关键作用。整合素簇作为细胞与底物之间传递机械力的通讯枢纽，在机械转导过程中，细胞产生并传递到底物的力会根据底物的刚度调节生化信号。近年来，尽管对机械转导的研究取得了诸多进展，大量 “黏附体蛋白” 被发现并明确了其在机械转导和细胞黏附中的作用，但大多数研究是在具有固定整合素配体的刚性底物上进行的，如玻璃或可变形的 2D 凝胶。在这些刚性底物上，肌动蛋白细胞骨架在黏附增强中发挥着关键的机械作用，肌动蛋白聚合形成小的新生黏附，肌动球蛋白收缩促使其发展为与应力纤维相连的大而致密的黏着斑。

然而，在生理环境中，细胞常常与柔软的底物相互作用，如 3D 基质或其他细胞的质膜，其中整合素配体并非固定不动，而是嵌入流体膜中。支持脂质双分子层（SLBs）是模拟质膜流体特性研究细胞 - 细胞黏附的常用模型膜。以往研究表明，用经典 RGD 肽功能化的 SLBs 上，细胞既不铺展，也不会形成大而致密的整合素黏附结构，如黏着斑和应力纤维，普遍认为移动的整合素 - 配体复合物无法在流体膜上作为锚定点促进细胞铺展，新生黏附也不能通过机械转导得到增强以促进在流体底物上的强黏附。但此前研究未考虑整合素受体 - 配体亲和力的影响，而这一因素可能显著调节细胞黏附。

二、研究材料与方法

（一）细胞系与培养

研究使用了多种细胞系，包括小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）和 HeLa 细胞。MEF 细胞系如 β1KO β1 - Halotag 及其衍生的表达不同荧光标记蛋白的细胞系，由相关实验室馈赠或通过慢病毒转导构建。所有细胞系在含有高葡萄糖和 GlutaMAX 的杜氏改良 Eagle 培养基（DMEM）中培养，并添加 10% 胎牛血清和 1% 青霉素 - 链霉素，在 37°C、5% CO?的湿润环境中培养，定期进行支原体污染检测。

（二）试剂与缓冲液

实验使用了多种试剂和缓冲液。Cell Buffer 用于细胞相关实验，Small Unilamellar Vesicles（SUV）buffer 用于制备 SUV。脂质包括 DOPC、DGS - NTA (Ni) 等，用于制备 SLBs。此外，还使用了多种抑制剂，如 Arp2/3 复合物抑制剂 CK - 666、formin 抑制剂 SMIFH2 等，用于研究细胞骨架相关机制。同时，使用了 MnCl?、β1 - 整合素特异性抗体等试剂。

（三）Invasin 制备

通过合成编码 Invasin 末端 474 个氨基酸的 DNA 序列，并将其克隆到 pMal p5x 表达载体中，在大肠杆菌中诱导表达。表达的融合蛋白经亲和纯化和 TEV 蛋白酶切割后，再通过尺寸排阻色谱法进行最终纯化，获得高纯度的 Invasin 蛋白。

（四）显微镜成像

采用旋转盘共聚焦显微镜对荧光脂质双分子层和细胞黏附进行成像。显微镜配备了多个激光器用于多通道荧光成像，能够获取 Z - stack 图像以详细分析细胞 - SLB 相互作用。成像过程中保持一致的成像条件，以确保数据的准确性和可比性。

（五）SLBs 制备与相关检测

SLBs 的制备包括多个步骤，如腔室准备、SUV 制备、SLB 形成和功能化。通过荧光漂白恢复技术（FRAP）定量评估 SLBs 的流动性，利用已知密度的荧光脂质 SLBs 对细胞黏附平面内的荧光物质密度进行校准，以准确量化整合素等分子的密度。

（六）细胞黏附实验与图像分析

细胞在实验前进行血清饥饿处理，用 Versene 溶液消化后标记 β1 - Halotag，再接种到含有 SLBs 的成像腔室中。通过明场显微镜观察细胞形态，根据细胞边缘和质心的运动情况将细胞分为 “颤抖” 细胞和 “黏附” 细胞。利用 ImageJ 软件对细胞图像进行处理，包括校正光照不均匀、检测整合素簇、识别膜管以及计算细胞的投影面积、圆度等参数，同时分析整合素簇、FA 蛋白、肌动蛋白和微管之间的关系。

三、研究结果

（一）细胞在 SLBs 上的 “颤抖” 和铺展依赖于配体

研究人员用 RGD 肽或 Invasin 功能化 SLBs，并通过 FRAP 确认其流动性。在添加 MEF 细胞后，通过明场显微镜观察到 “颤抖” 细胞和 “黏附” 细胞，且后者比例随时间增加。RGD - SLBs 上细胞黏附更快，可能是由于其更高的有效 RGD 密度和更广泛的整合素结合类型。Mn2?可加速 Invasin - SLBs 上细胞的黏附，但对 RGD - SLBs 上细胞黏附动力学无影响。在细胞铺展方面，RGD - SLBs 上的成纤维细胞无论是否用 Mn2?处理，都不显著铺展，而 Invasin - SLBs 上的细胞铺展明显，且 Mn2?处理后铺展更显著。这表明整合素激活对 Invasin - SLBs 上细胞黏附和铺展有重要影响，且这种影响在两种配体系统中存在差异。

（二）β1 - 整合素簇在 Invasin - SLBs 上比在 RGD - SLBs 上更密集、更大

利用共聚焦显微镜研究细胞黏附最初一小时内 β1 - 整合素的聚集情况，通过荧光校准和图像分割算法量化整合素簇的面积和密度。结果显示，45 分钟时，Invasin - SLBs 上的 β1 - 整合素簇比 RGD - SLBs 上的更大、更密集，且与 Mn2?处理无关。降低 RGD 在 SLBs 上的表面分数会导致 β1 - 整合素簇密度和总面积下降，细胞铺展水平仍较低。此外，Invasin - SLBs 上的 β1 - 整合素簇能招募更多的 FA 蛋白，除 talin 外，其他 FA 蛋白在 Invasin - SLBs 上的相对富集度更高，表明 Invasin - SLBs 上的细胞受到更高的机械力。通过调节 Invasin 与 β1 - 整合素的亲和力实验，进一步证实了配体 - β1 - 整合素亲和力是 β1 - 整合素聚类的重要参数。

（三）黏着斑蛋白在 β1 - 整合素簇处募集

在研究黏着斑蛋白与 β1 - 整合素簇的关系时，发现 F - 肌动蛋白在 RGD - SLBs 上的 β1 - 整合素黏附簇处比 Invasin - SLBs 上更富集，但通常与机械转导相关的肌动蛋白应力纤维在两种 SLBs 上均不存在，这表明肌动蛋白并非驱动 Invasin - SLBs 上 FA 成熟的因素。而微管在 Invasin - SLBs 上的 β1 - 整合素簇处的相对增加量几乎是 RGD - SLBs 上的两倍，且连接 talin 与微管的适配蛋白如 KANK1 和 ELKS 也在 Invasin - SLBs 上的 β1 - 整合素簇处富集，表明微管参与了 Invasin - SLBs 上 β1 - 整合素簇的成熟过程。

（四）动力蛋白沿垂直微管的拉动导致整合素簇的生长

在机械转导过程中，流体 SLBs 上的整合素簇所受侧向力可忽略不计，而垂直力可能导致整合素簇成熟。研究人员观察到 Invasin - SLBs 上的整合素簇与膜管相连，且与 RGD - SLBs 相比，Invasin - SLBs 上具有更多的膜管相关细胞和更高的膜管数量。通过抑制细胞骨架聚合和相关马达蛋白的实验发现，抑制 formin 和 Arp2/3 复合物对管形成频率和整合素聚类影响较小，抑制 Rho 激酶会减少膜管形成和 β1 - 整合素簇的大小与密度，而抑制微管聚合（用 nocodazole 处理）或动力蛋白活性（用 ciliobrevin D 处理）会显著减少膜管形成和 β1 - 整合素簇的总面积与密度，表明垂直力依赖于微管并由动力蛋白活性驱动。此外，研究人员提出了一个平均场理论模型，该模型考虑了结合亲和力、底物流动性和微管垂直力之间的相互作用，其预测结果与实验观察一致，进一步支持了机械转导在 SLBs 上的机制。

（五）整合素簇以动力蛋白和微管依赖的方式被推向细胞周边

在 Invasin - SLBs 上，细胞形成突起并对称铺展，高整合素密度的簇与高铺展面积和低细胞圆度相关。研究发现，铺展细胞中整合素和 paxillin 簇优先位于细胞周边，而非铺展细胞中则无此现象，且 “密集” 整合素簇的细胞中，整合素簇更靠近细胞边界。同时，细胞铺展与膜管的存在呈正相关，铺展细胞中心的膜管更多。用 nocodazole 或 ciliobrevin D 处理细胞会抑制整合素簇向细胞周边的定位和细胞铺展，而抑制 Rho 激酶会增加铺展细胞的比例。这些结果表明，动力蛋白沿微管的活性将大而成熟的 β1 - 整合素簇推向细胞周边，有助于细胞在 SLBs 上通过富含肌动蛋白的突起进行铺展。

四、研究结论与讨论

该研究表明，细胞能够在以 Invasin 为配体的流体 SLBs 上黏附、铺展并形成大而致密的 β1 - 整合素簇，类似于在玻璃上形成的黏着斑。在 SLBs 上，β1 - 整合素 - 配体亲和力与簇密度直接相关，这与理论模型相符。与在玻璃上的情况不同，由于底物的流动性，与质膜相切的肌动蛋白相关力在 SLBs 上的整合素黏附中不起主导作用，微管解聚会强烈抑制细胞在 SLBs 上的黏附，而在玻璃上则会增加黏着斑的大小和密度。

研究还发现，微管和动力蛋白在细胞与 SLBs 相互作用中发挥了重要作用。微管和动力蛋白施加垂直力于整合素簇，导致膜管形成并部分负责整合素聚类；同时，它们还施加侧向力将整合素簇推向细胞周边。细胞铺展取决于微管驱动的整合素簇推动和细胞边缘的肌动球蛋白收缩之间的相互作用，这种相互作用也可能负责细胞周边整合素簇的致密化。此外，在 HeLa 细胞上也观察到类似的依赖动力蛋白 / 微管的膜管形成现象，表明这种与垂直于黏附平面的力相关的机械转导在多种细胞类型中存在。

该研究利用功能化 SLBs 研究了细胞在流体界面上的早期黏附阶段，揭示了在刚性底物上可能存在但因固定配体而无法观察到的力。研究结果对于理解细胞 - 细胞相互作用（如脑细胞、免疫细胞等）具有重要意义，同时也表明细胞在流体界面上的黏附可通过受体 - 配体亲和力进行强烈调节，这一调节机制可能在 T 细胞或 B 细胞的选择性黏附中发挥作用，为进一步研究细胞黏附机制和相关疾病的治疗提供了新的思路和理论基础。