甲基钴胺素通过参与气凝胶素E来防止肝功能衰竭

Gasdermin E （GSDME）是一种热腐细胞死亡效应因子，是热腐组织损伤的重要靶点。在这里，作者表明，base-off构象的甲基钴胺素与GSDME中的Cys180相协调，以防止caspase-3/GzmB-GSDME相互作用，从而防止GSDME介导的肝衰竭。

　　

维生素 B12 活性形式甲钴胺：治疗肝衰竭的新希望

中国药科大学（State Key Laboratory of Natural Medicines, China Pharmaceutical University）的研究人员在《Nature Communications》期刊上发表了题为 “Methylcobalamin protects against liver failure via engaging gasdermin E” 的论文。该研究意义重大，发现了甲钴胺（Methylcobalamin，MeCbl）这一内源性维生素 B12 辅酶形式，可作为 Gasdermin E（GSDME）的特异性抑制剂，为治疗胆汁淤积性肝衰竭及其他由 GSDME 引发的无菌性炎症和器官衰竭带来了新的希望，有望推动相关疾病治疗药物的研发。

一、研究背景

程序性细胞死亡在机体的宿主防御和疾病发生发展中起着关键作用，其中焦亡是感染性和无菌性疾病中的重要病理过程。Gasdermin 家族蛋白在焦亡中发挥核心作用，GSDME 普遍表达于多种组织和器官，在感染性和无菌性疾病中均至关重要。化疗药物或肠道病毒感染可激活 caspase-3-GSDME 通路，引发肠道或其他器官损伤；细胞毒性淋巴细胞释放的颗粒酶 B（GzmB）也能切割 GSDME，诱导自身免疫性疾病，这些都表明 GSDME 可能是介导焦亡性器官损伤的关键执行者。

肝衰竭是重症监护病房（ICU）中常见且严重的疾病，高达 20% 的患者会出现肝衰竭，除肝移植外缺乏有效的治疗手段，患者预后差、死亡率高。病毒感染、胆汁淤积功能障碍和药物性肝损伤是继发性或获得性肝衰竭中最常见的肝损伤形式，是不良预后和住院时间延长的重要预测因素。此前研究发现，胆汁淤积时，高水平胆汁酸可促进 Apaf-1/caspase-4 焦亡小体的组装，激活 caspase-3-GSDME 介导的焦亡，进而导致胆汁淤积性肝衰竭，且在 Gsdme 敲除小鼠中，胆汁淤积诱导的死亡率可完全逆转，这表明 GSDME 介导的焦亡可能是导致肝衰竭的主要细胞死亡类型，因此 GSDME 有望成为对抗肝损伤的关键靶点。

此前虽有研究表明富马酸二甲酯（DMF）可阻断 GSDME 介导的焦亡，但 DMF 并非特异性 GSDME 抑制剂，还会抑制 GSDMD 和半胱氨酸依赖性蛋白酶，且无证据表明其对肝衰竭有效，治疗窗窄，不适用于肝衰竭治疗。由于 GSDME 晶体结构尚未确定，难以进行基于结构的药物设计。鉴于宿主来源的损伤相关分子模式（DAMPs）如胆汁酸可直接激活 GSDME 引发焦亡，研究人员推测可能存在内源性代谢物能抑制 GSDME 激活，因此开展了本研究，旨在寻找特异性 GSDME 抑制剂。

二、研究材料和方法

（一）材料

研究使用多种质粒、腺病毒、抗体和试剂，包括合成并克隆的 GSDME 相关质粒、多种来源的抗体、内部合成的人类内源性代谢物化合物库、重组蛋白、细胞系、实验动物等。实验动物包含野生型（WT）和基因敲除小鼠，以及斑马鱼。

（二）方法

1. 高通量筛选：利用荧光信号检测脂质体泄漏，从内部开发的人类内源性代谢物化合物库中筛选能够抑制 GSDME-NT 孔形成活性的化合物，以鉴定潜在的 GSDME 抑制剂。
2. 细胞实验：对多种细胞系和原代细胞进行处理，诱导 GSDME 或 GSDMD 介导的焦亡，检测细胞毒性、焦亡情况，通过多种实验方法探究 MeCbl 对细胞焦亡的影响机制，如免疫印迹分析、免疫荧光显微镜观察、酶活性测定等。
3. 动物实验：构建多种小鼠肝衰竭模型，包括胆管结扎（BDL）、化疗药物诱导、刀豆蛋白 A（Con A）诱导等，给予小鼠 MeCbl 或 DMF 处理，检测血清转氨酶、炎症因子等指标，评估肝损伤程度和小鼠生存率；构建斑马鱼肝损伤模型，观察 MeCbl 对斑马鱼全身和肝脏损伤的保护作用。
4. 分子生物学实验：运用分子对接、微尺度热泳（MST）、蛋白质共免疫沉淀（Co-IP）等技术，研究 MeCbl 与 GSDME 的结合位点、相互作用以及对 GSDME 激活的影响；采用质谱分析技术，如 FPOP-LC-MS/MS、UHPLC-timsTOF HT 质谱分析，确定 MeCbl 在 GSDME 上的结合位点和修饰情况。

（三）技术路线

首先通过高通量筛选从化合物库中筛选出潜在的 GSDME 抑制剂，然后对筛选出的化合物进行细胞毒性和特异性验证，确定 MeCbl 为特异性 GSDME 抑制剂。接着深入研究 MeCbl 抑制 GSDME 介导焦亡的机制，包括与 GSDME 的结合位点、对 GSDME 切割和孔形成活性的影响等。构建动物模型，在体内验证 MeCbl 对肝衰竭的保护作用，探究其保护作用是否依赖于抑制 GSDME，最后通过一系列实验进一步明确 MeCbl 的作用机制和特异性。

三、研究结果

（一）甲钴胺是 GSDME 的特异性直接抑制剂

研究人员利用脂质体泄漏试验从 829 种化合物中筛选出 9 种能抑制脂质体泄漏至少 70% 的化合物，经细胞毒性和特异性验证，确定 MeCbl 为最强的 GSDME 抑制剂。MeCbl 对重组 caspase-3 活性无抑制作用，且特异性结合 GSDME，而非 caspase-3 或 GSDMD。MeCbl 抑制脂质体泄漏的 IC50 为 0.47 μM，低于阳性对照 DMF（0.826 μM），且能有效抑制 caspase-3 和 GzmB 切割 GSDME 引发的脂质体泄漏，但对预切割的 GSDME 诱导的脂质体泄漏无明显抑制作用，表明 MeCbl 直接作用于 GSDME，而非上游事件。

（二）甲钴胺抑制 GSDME 介导的焦亡

在人肝癌细胞系 HepG2 中，MeCbl 以剂量依赖方式显著减弱脱氧胆酸（DCA）诱导的细胞毒性，IC50 为 2.25 μM，低于 DMF（14.88 μM），且对 GSDMD 依赖的细胞毒性无明显影响，表明其特异性抑制 GSDME 介导的焦亡。MeCbl 可通过直接抑制 GSDME 切割，维持 HepG2 细胞膜完整性，不影响 caspase-3 活性，还能抑制多种刺激诱导的细胞焦亡。研究发现只有 MeCbl 能显著抑制 GSDME 介导的脂质体泄漏和焦亡，且 MeCbl 对 GSDME 依赖的焦亡抑制作用在肝细胞和巨噬细胞中均有效。

（三）甲钴胺通过与 GSDME 的 Cys180 配位发挥作用

预孵育 N - 乙酰半胱氨酸（NAC）可削弱 MeCbl 抑制肝细胞焦亡的能力，表明 MeCbl 可能通过与半胱氨酸残基结合发挥作用。光谱分析显示，MeCbl 与 GSDME 结合后呈碱基脱离构象，可能与 GSDME 的半胱氨酸残基配位。分子对接和质谱分析确定 MeCbl 与 GSDME 的 Cys180 配位。突变研究表明，Cys180 是 caspase-3/GzmB 识别和切割 GSDME 的关键位点，MeCbl 与 Cys180 结合，抑制 GSDME 切割和焦亡。在多种细胞和动物实验中，Cys180 突变会影响 MeCbl 对 GSDME 的抑制效果，证实 Cys180 是 MeCbl 发挥作用的关键位点。

（四）甲钴胺保护机体免受 GSDME 引发的急性肝衰竭

在斑马鱼模型中，MeCbl 显著降低 DCA 诱导的全身和肝脏损伤，抑制 GSDMEa 的切割，提高斑马鱼生存率。在多种小鼠肝衰竭模型中，MeCbl 降低血清转氨酶、炎症因子水平，抑制 GSDME 切割，减轻肝损伤，提高小鼠生存率，且效果优于 DMF。在 Gsdme 敲除小鼠中，MeCbl 对肝损伤指标无明显影响，表明其保护作用依赖于抑制 GSDME。进一步研究证实，Cys180 是 MeCbl 在体内发挥作用的关键位点，突变 Cys180 会使小鼠对肝损伤和炎症反应更敏感，MeCbl 无法有效保护。同时，MeCbl 对由鼠伤寒沙门氏菌或对乙酰氨基酚诱导的肝衰竭无明显保护作用，因为这两种因素诱导的肝衰竭不依赖于 GSDME。

四、研究结论与讨论

本研究确定 MeCbl 是一种强效且特异性的 GSDME 抑制剂，通过与 GSDME 的 Cys180 配位，抑制 caspase-3/GzmB 对 GSDME 的识别和切割，从而抑制 GSDME 介导的焦亡。在多种肝衰竭模型中，MeCbl 展现出强大的保护作用，可降低血清转氨酶、炎症因子水平，减轻肝损伤，提高生存率，且安全性良好。这一发现为胆汁淤积性肝衰竭及其他由 GSDME 引发的无菌性炎症和器官衰竭提供了潜在的治疗药物，有望将 MeCbl 重新用于临床治疗这些疾病。

与以往发现的 GSDME 抑制剂相比，MeCbl 具有明显优势。DMF 虽能抑制 GSDME 切割，但并非特异性抑制剂，且在高剂量时有毒性，可能影响多种细胞信号通路，不适用于肝衰竭治疗；而 MeCbl 特异性强，对 GSDMD、caspases 和坏死性凋亡细胞死亡信号无影响，安全性已在临床应用中得到充分验证。

此外，本研究还揭示了 GSDME 中 Cys180 在 caspase-3/GzmB 识别和 MeCbl 结合中的关键作用，为深入理解 GSDME 介导的焦亡机制提供了新视角。研究结果支持将 MeCbl 直接重新用作药物，或作为先导化合物开发更特异性的 GSDME 抑制药物，以预防 GSDME 介导的焦亡。尽管不能排除 MeCbl 可能通过其他机制发挥肝保护作用，但抑制 GSDME 的作用可能占主导地位。

GSDME 在多种器官中广泛表达，参与多种疾病的病理过程，如化疗药物或肠道病毒感染可诱导 GSDME 介导的肠道、肺等器官损伤，自身免疫性疾病中也存在 GSDME 的异常激活。因此，合理推测 MeCbl 可能对其他器官的 GSDME 介导的损伤具有类似的保护作用，这为未来的研究开辟了新方向，有望进一步拓展 MeCbl 在临床治疗中的应用范围。