TLR3蛋白微结合剂的重新设计

本研究报道了模式识别受体TLR3的微型蛋白结合物的计算设计。当寡聚化时，微小蛋白结合物在细胞中诱导TLR3信号，这表明它们可能是疫苗或传染病或癌症治疗的有用成分。

　　

计算设计新型蛋白激动剂，靶向调控 TLR3 信号通路

在免疫学和药物研发领域，华盛顿大学蛋白质设计研究所等机构的研究人员取得了一项重要进展。由 Chloe S. Adams、Hyojin Kim 等多位学者合作完成的研究成果 “De novo design of protein minibinder agonists of TLR3” 发表于《Nature Communications》期刊。该研究利用计算蛋白质设计技术，成功开发出能与人类 Toll 样受体 3（TLR3）特异性结合的新型微型蛋白激动剂，为基于蛋白质的疫苗佐剂及相关疗法的开发奠定了关键基础，有望克服现有核酸类 TLR3 激动剂的诸多局限，推动免疫治疗领域的发展。

一、研究背景

（一）Toll 样受体与免疫激活

Toll 样受体（TLRs）是固有免疫系统的关键模式识别受体，人体中存在 10 种 TLRs，各自识别不同的病原体相关分子模式，启动免疫应答。TLRs 为 I 型跨膜蛋白，其胞外域含多个富含亮氨酸的重复序列（LRRs），负责识别配体，配体结合后引发 TLR 二聚化或多聚化，招募衔接分子激活下游信号通路，如核因子 -κB（NF-κB）和干扰素调节因子（IRF）3、7 等，促使促炎细胞因子、趋化因子和 I 型干扰素产生，影响后续适应性免疫，因此 TLRs 是疫苗佐剂的理想靶点 。

（二）现有疫苗佐剂的困境

铝盐长期以来是常用疫苗佐剂，但近年来，新型佐剂不断涌现，如 TLR4 激动剂单磷酰脂质 A（MPLA）和 TLR9 激动剂 CpG 已获许可应用。即便如此，疫苗佐剂开发常受知识产权、安全性及配方难题制约，成为疫苗研发的瓶颈。

（三）TLR3 的独特价值与挑战

TLR3 在多种细胞的内体中表达，可强烈诱导 I 型干扰素，且是 MyD88 非依赖性的，通过 TRIF 衔接蛋白启动下游信号，在交叉启动中发挥重要作用。不过，其天然配体双链 RNA（dsRNA）稳定性差、结构不均一且具有多效性，会激活其他免疫受体，导致过度刺激和自身免疫问题。开发化学性质明确、稳定且易于配制的 TLR3 特异性激动剂迫在眉睫。

（四）计算蛋白设计的机遇

近十年来，计算蛋白质设计技术取得显著进展，能够设计出可特异性结合靶蛋白的微型结合蛋白（minibinders），部分已显示出激动靶受体并诱导功能性生物反应的潜力，这为从头设计 TLR 激动剂提供了可能，有望开辟基于蛋白质的新型佐剂类别。然而，TLRs 高度糖基化、多数缺乏已知蛋白配体且难以重组表达和表征，给设计工作带来极大挑战。

二、研究材料与方法

（一）计算设计

以 TLR3 胞外域（PDB ID: 1ZIW）为基础，运用 RifGen、PatchDock、RifDock、FastDesign 和 MotifGraft 等工具，基于多种 Rosetta 指标（如与疏水残基的接触分子表面、预测结合能 ddG 和空间聚集倾向 SAP）对大量设计进行筛选，确定针对 TLR3 的微型结合蛋白候选库。

（二）文库制备

将设计序列优化为 65 个氨基酸并进行密码子优化，合成寡核苷酸，构建文库。

（三）酵母表面展示

通过电穿孔将微型结合蛋白文库导入酵母，在酵母表面展示微型结合蛋白，利用荧光标记抗体和生物素化的 TLR3 胞外域，借助荧光激活细胞分选技术（FACS）筛选结合细胞。

（四）深度序列分析

采用 Illumina NextSeq 测序对筛选细胞进行测序，使用 PEAR 程序组装序列，分析突变对结合亲和力的影响，生成热图。

（五）组合文库制备

从单点饱和突变（SSM）热图中筛选增强亲和力的突变，利用 SwiftLib 构建含突变的组合文库，转化酵母进行筛选。

（六）蛋白表达与纯化

将编码微型结合蛋白的基因克隆到表达载体，在大肠杆菌中表达，经亲和层析和尺寸排阻色谱（SEC）纯化；TLR3 胞外域通过杆状病毒在昆虫细胞中表达并纯化。

（七）生物膜干涉技术（BLI）

测定微型结合蛋白与 TLR3 的结合亲和力。

（八）圆二色谱（CD）

分析微型结合蛋白的二级结构稳定性。

（九）冷冻电镜（cryo-EM）相关技术

共表达 TLR3 胞外域和微型结合蛋白，纯化复合物，制备冷冻电镜样品，收集数据，进行图像处理、模型构建和精修，解析复合物结构。

（十）细胞实验

使用表达 TLR3 且含 NF-κB - GFP 报告基因的 HEK293 - TLR3hi 细胞，通过流式细胞术检测 NF-κB 激活情况，评估微型结合蛋白对 TLR3 的激活作用。

三、研究结果

（一）TLR3 微型结合蛋白的计算设计

综合考虑 TLR3 的糖基化、表面极性及激动剂设计需求，研究人员选定两个目标位点（Site A 和 Site B）。运用 Rosetta RifDock 管道设计了大量候选微型结合蛋白，经筛选后选取 23,789 个进行实验表征。通过酵母表面展示和 FACS 筛选，最终从众多候选中鉴定出 11 个与 TLR3 结合的微型结合蛋白，成功率与先前研究相符。

（二）TLR3 微型结合蛋白的生化表征

11 个结合蛋白均靶向 Site A，推测 Site B 因靠近 N - 连接聚糖而阻碍结合。对结合蛋白进行表达、纯化和 BLI 检测，发现 6 个蛋白与 hTLR3 具有不同亲和力，其中 minibinders 6 - 8 结合幅度较高。通过 SSM 构建突变文库并筛选，部分突变可增强结合亲和力，综合突变效果更佳。优化后的 minibinders 7 和 8 的变体与 hTLR3 的结合亲和力显著提高，CD 分析表明它们在高温变性后可复性，具有较好的结构稳定性。

（三）微型结合蛋白 - TLR3 复合物的结构表征

选择 minibinders 7.7 和 8.6 进行结构研究，经冷冻电镜解析，二者与 TLR3 复合物的分辨率达 2.9 ?。minibinder 7.7 的 α3 螺旋因与 N413 聚糖的空间冲突而部分无序，而 minibinder 8.6 维持稳定的 3 - 螺旋束结构。二者与 TLR3 的结合方式略有差异，均通过疏水和静电相互作用结合，结构分析揭示了关键相互作用残基，解释了部分突变增强结合亲和力的原因。

（四）多价微型结合蛋白激活 TLR3

构建多种多价形式的微型结合蛋白，包括串联重复的二价、四价、六价形式及与反平行卷曲螺旋融合的二聚体形式。BLI 和 SEC 实验证实多价形式可与 TLR3 结合并诱导其多聚化。在 TLR3hi 细胞实验中，多价微型结合蛋白能激活 NF-κB，诱导 GFP 表达，且四价 8.6 激活效率较高，与已知激动剂 poly (I:C) 相当，不同连接子长度和价态对激活影响较小，部分微型结合蛋白不影响 dsRNA 与 TLR3 的结合 。

四、研究结论与讨论

本研究利用计算蛋白质设计成功开发出 TLR3 的微型蛋白激动剂，这是首次针对 TLR3 凹面设计结合蛋白，尽管面临诸多挑战，但仍取得关键进展。发现微型结合蛋白与聚糖的空间竞争现象，这为设计具有开关行为的微型结合蛋白提供了新思路。多价微型结合蛋白在细胞实验中激活了 NF-κB，显示出作为蛋白质基佐剂的潜力，但要成为实用佐剂，还需进一步优化，如实现体内靶向递送至细胞内体，优化多聚体几何结构以更好模拟天然信号复合物等。结合新型计算设计方法，有望推动基于蛋白质的 TLR 激动剂的开发，为疫苗佐剂和免疫治疗开辟新方向，具有重要的理论意义和临床应用潜力。

这项研究成果为解决现有疫苗佐剂难题提供了新途径，在未来疫苗研发和免疫治疗领域具有广阔的应用前景，有望改善疫苗性能，提高免疫治疗效果，为人类健康事业做出重要贡献。