多功能硝酸盐呼吸异养生物是以前隐藏的硫循环贡献者

除了长期建立的化能岩石自养生物，Shao等人的一项新研究揭示了异养反硝化菌是以前被掩盖的硫循环的贡献者，对温室气体减排具有深远的影响。

　　

探索异养反硝化菌新功能：对硫循环及生态环境的关键意义

哈尔滨工业大学城市水资源与环境国家重点实验室的研究人员在Nature Communications期刊上发表了题为 “Versatile nitrate-respiring heterotrophs are previously concealed contributors to sulfur cycle” 的论文。该研究揭示了一类此前未被充分认识的异养反硝化菌在硫循环中的重要作用，为理解微生物群落生态功能、调控碳氮硫循环以及应对气候变化提供了新视角，对环境科学、微生物学等领域的研究与实践具有重要指导意义。

研究背景

反硝化作用能将硝酸盐转化为氮气，在全球氮循环中占据重要地位，对生态系统的氮平衡意义重大。然而，不完全反硝化会产生氧化亚氮（），这种强效温室气体不仅会加剧气候变暖，还会对臭氧层造成破坏，引发酸雨。在许多河口、沿海地区及海洋缺氧区域，硫循环对生物地球化学过程的调节起着关键作用。但硫化氢（）作为一种有毒物质，会强烈抑制反硝化过程中的关键酶，进而影响反硝化活性，导致排放增加。以往研究普遍认为，化能自养反硝化菌是负责硫化合物氧化和硫化物解毒的主要生物。但近期有研究表明，部分化能异养反硝化菌（即兼性硫化物氧化异养反硝化菌，F-SOHDs）也具备氧化硫化物的能力，不过其在自然生态系统中的存在状况和生态作用仍有待深入探究。

研究材料与方法

河口采样与动态培养

研究人员于 2019 年 8 月在东亚最大水系松花江的主要营养交换热点区域采集河口沉积物。采集多个沉积物核心样本及上覆水样本，测定其理化性质。在现场进行沉积物培养实验，测试元素循环活性，通过添加不同物质（如硫化物、有机物等），监测硝酸盐浓度、硫化物浓度、气体产物及铵盐浓度等变化，探究硫循环与反硝化作用的关系。

生物标志物定量 PCR

运用 PowerSoil DNA 提取试剂盒从沉积物中提取 DNA，针对参与硫酸盐还原、硫化物氧化、硝酸盐还原、反硝化及异化硝酸盐还原为铵（DNRA）过程的相关基因设计引物，采用定量 PCR 技术测定这些基因的拷贝数，以了解微生物群落中相关功能基因的丰度。

同位素培养实验

在厌氧工作站中对沉积物进行预处理，去除杂质并预培养以激活微生物活性。设置不同的微宇宙培养条件，添加无机碳、有机碳、硝酸盐、硫化物等，并分别使用和进行稳定同位素标记。培养过程中定期采集液体和顶空气体样本，测定相关物质浓度，以此研究微生物对不同碳源的利用及代谢情况。

功能鉴定与群落同位素响应校正

通过等密度超速离心法分离不同浮力密度的 DNA，对各组分进行 16S rRNA 和功能基因定量分析。依据不同处理下微生物在重 DNA 组分中相对丰度的变化，判断微生物的代谢功能，明确其属于化能自养菌、异养菌，以及是否具备硝酸盐还原、硫化物氧化等能力。

16S rRNA 基因测序

提取 DNA 后，扩增细菌 16S rRNA 基因的 V3 - V4 区域或近乎全长基因，采用 Illumina MiSeq 或 PacBio Sequel II 平台进行测序。对测序数据进行聚类和分类学注释，分析微生物群落组成。

宏基因组组装与基因组分箱

对重 DNA 组分、原始沉积物等样本进行宏基因组测序，经数据预处理后，使用 SPAdes 软件进行从头组装，再利用多种工具进行基因组分箱和优化，最终获得高质量的宏基因组组装基因组（MAGs），并进行基因注释和功能分析。

基于基因组和 SIP 的 F - SOHDs 富集

利用定制的测序批式反应器（SBR）和血清瓶培养相结合的方式富集 F - SOHDs。在 SBR 中交替使用含硫化物和不含硫化物的培养基进行长期培养，之后通过稀释转移法进一步纯化。对富集培养物进行多种生理实验，检测其对硫源的氧化能力、反硝化能力及温室气体排放情况。

生理实验

选用 7 种不同的培养物（包括传统异养反硝化菌富集培养物 HD、化能自养硫化物氧化反硝化菌纯培养物 CD、以 F - SOHDs 为主的富集培养物 ENR_U2 和 ENR_C4 等），在不同有机碳浓度条件下，利用传感器和气相色谱仪等设备，监测可溶性、以及温室气体的浓度变化，计算反硝化程度和硫化物作为电子供体的贡献比例。

系统发育树和基因分析

基于 31 个保守蛋白标记，使用相关软件进行多序列比对、修剪和系统发育树构建，分析微生物的系统发育关系，深入探究 F - SOHDs 在微生物进化中的地位。

研究结果

硫化物和有机物促进河口沉积物中硝酸盐还原

研究人员采集的河口沉积物虽原位硫化物浓度较低，但硫循环活跃。添加硫化物可使硝酸盐消耗增加 30.2%，添加有机物后，硝酸盐迅速减少，同时伴随氮气、氧化亚氮和铵盐的产生，且相关功能基因丰度较高。这表明硫化物和有机物可作为电子供体，共同促进河口沉积物中的硝酸盐呼吸作用，为后续研究奠定了基础。此结论是通过对河口沉积物进行现场培养实验，监测添加硫化物和有机物前后硝酸盐及相关产物浓度变化，并结合功能基因定量分析得出的。

异养反硝化菌意外的硫氧化作用

通过 DNA 稳定同位素探针（DNA - SIP）实验发现，在添加硫化物的微宇宙中，包括 Thauera、Azoarcus 和 Pseudomonas 等在内的异养反硝化菌，在利用有机碳的同时，相对丰度增加，且对的同化作用增强，表明它们参与了硫氧化和反硝化过程。此外，与仅添加有机碳和硝酸盐的处理相比，添加硫化物后这些异养菌的某些基因（如 sqr 和 nirS）在重 DNA 组分中的丰度显著提高。研究还发现，在无硫化物添加时，部分编码 sqr/soxB 的异养反硝化微生物也能被激活。综合这些结果可知，异养反硝化菌可能在不依赖硫化物的情况下参与硫氧化，且在该生态系统中，异养菌可能主导硫氧化和反硝化过程，而非传统认为的专性化能自养菌。这些结论是基于 DNA - SIP 实验，分析不同处理下微生物群落组成变化、功能基因在 DNA 密度梯度中的分布以及微生物对不同碳源的同化情况得出的。

宏基因组揭示 F - SOHDs 的代谢潜力

宏基因组测序共重建了 63 个高质量的 MAGs，其中 15 个 MAGs 代表异养硫氧化菌，它们具有近乎完整的反硝化或 DNRA 途径，且编码多种硫氧化酶和硝酸盐还原酶。与已知的化能自养反硝化菌不同，这些 F - SOHDs 缺乏典型的固定途径，更倾向于利用有机碳源。此外，MAGs 中还检测到许多与异养代谢相关的基因，进一步证实了其异养特性。该结果为 F - SOHDs 在沉积物中的代谢功能提供了基因组学证据，表明它们在硫和氮循环中具有重要作用。这是通过对微宇宙和自然沉积物的重 DNA 组分进行宏基因组测序，组装和注释 MAGs，分析基因功能和代谢途径得出的。

长期富集培养证实 F - SOHDs 的非硫依赖生理特性

利用定制生物反应器系统成功富集了 F - SOHDs，并维持了 612 天。富集培养物 ENR_C4 能够氧化多种硫化合物，且在有硫化物存在时，Thauera 和 Pseudomonas 等菌属相对丰度较高。连续的底物添加实验表明，F - SOHDs 能够根据硫化物的存在与否调整代谢方式，在无硫化物时仍具备异养反硝化能力，且有机物对硫氧化至关重要。这一结果从生理层面验证了 F - SOHDs 的代谢灵活性和非硫依赖特性，有助于深入理解其生态适应性。该结论是通过长期富集培养实验，监测富集培养物对不同硫源的氧化能力、微生物生长情况以及在不同底物条件下的代谢变化得出的。

F - SOHDs 在硫化物解毒和减少排放方面的重要意义被忽视

实验表明，在富含有机物和限制有机物的条件下，以 F - SOHDs 为主的富集培养物能在 32 小时内完全消耗硫化物，而传统异养反硝化菌富集培养物对硫化物的消耗极少。电子流平衡分析显示，硫化物可作为重要的补充电子供体，促进 F - SOHDs 的反硝化作用，减少有机物的消耗。在低有机物条件下，硫化物提供的额外电子可推动完全反硝化。此外，F - SOHDs 能够显著降低排放，而传统异养反硝化菌在硫化物存在时会产生大量。这表明 F - SOHDs 在硫化物解毒和减少温室气体排放方面具有关键作用，对生态系统健康和气候调节意义重大。这些结论是通过对比不同培养物对硫化物的去除效率、分析电子供体贡献以及监测排放情况得出的。

研究结论与讨论

研究人员通过多种实验方法，在河口沉积物中发现了一类此前未被充分认识的异养反硝化菌 F - SOHDs。它们能够利用硫化合物作为补充电子供体，实现硫化物解毒和完全反硝化，有效减少排放。F - SOHDs 广泛存在于河口沉积物微生物群落中，在碳、氮、硫循环中发挥着重要作用。与传统认知中化能自养反硝化菌主导硫氧化和解毒不同，本研究表明异养反硝化菌在该过程中也具有关键作用，这丰富了人们对微生物代谢多样性和生态功能的理解。

在生态系统中，硫化物的毒性会抑制许多微生物的生长和代谢，而 F - SOHDs 独特的硫氧化能力使其能够适应硫化物胁迫环境。它们在无硫化物时进行非硫依赖的异养反硝化，有硫化物时则开启硫氧化途径，这种代谢灵活性有助于缓解硫化物对生态系统的毒性影响，促进生态系统的稳定。同时，F - SOHDs 在减少排放方面的能力，对缓解温室效应具有重要意义。其通过氧化硫化物，避免硫化物螯合 NosZ 中的铜，保证能够继续还原为氮气，从而降低了温室气体的排放。

此外，研究还发现 F - SOHDs 在其他环境（如温泉、海水、污水生物反应器等）中也可能存在，这意味着它们在更广泛的生态系统中参与碳、氮、硫循环，对维持全球生态平衡具有潜在重要作用。在未来的研究中，需要进一步探究 F - SOHDs 在不同生态系统中的分布、多样性及其生态功能的具体机制。从应用角度看，F - SOHDs 有望应用于污水处理等领域，通过生物强化技术将其引入缺氧反硝化池，增强异养反硝化活性污泥对硫化物的抗性，提高污水处理效率，同时减少排放，为实现环境可持续发展提供新的策略和途径。

该研究成果不仅为微生物生态学研究提供了新的理论依据，还为解决环境问题提供了潜在的生物资源和技术手段，对推动环境科学和微生物学的发展具有重要意义。