NSm是布尼亚病毒在脊椎动物和蚊子宿主之间传播的关键决定因素

布尼亚病毒是一大类病毒，可感染多种生物，包括昆虫、动物、植物和单细胞生物。在这里，Terhzaz等人表明非结构蛋白NSm是蚊子中肠细胞间传播和出口所必需的。

　　

布尼亚病毒传播关键蛋白 NSm 的研究解读

格拉斯哥大学医学研究委员会（MRC）- 病毒研究中心的研究人员 Selim Terhzaz、David Kerrigan 等人在《Nature Communications》期刊上发表了题为 “NSm is a critical determinant for bunyavirus transmission between vertebrate and mosquito hosts” 的论文。该研究揭示了布尼亚病毒传播过程中的关键蛋白 NSm 的重要作用，对于理解病毒跨宿主传播机制、开发防控策略意义重大。

一、研究背景

布尼亚病毒目（Bunyavirales）是一类庞大的病毒，可感染节肢动物、脊椎动物、植物和原生动物等多种生物。部分布尼亚病毒经吸血节肢动物在脊椎动物宿主间传播，引发严重人畜疾病，如克里米亚 - 刚果出血热病毒（CCHFV）和裂谷热病毒（RVFV），给全球公共卫生和经济带来沉重负担。由于缺乏疫苗和有效媒介控制措施，加之气候变化影响，此类病毒的威胁日益严峻。

布尼亚病毒虽宿主范围和致病性各异，但具有相似的基因组结构和病毒特征。其基因组为分节段单链 RNA，编码少量蛋白质，在细胞质中复制，在高尔基体膜上组装和出芽。部分布尼亚病毒的 M 节段编码非结构蛋白 NSm，然而除了蓟马传播的番茄斑萎病毒（TSWV）中 NSm 作为运动蛋白参与病毒核糖核蛋白的细胞间运输外，NSm 在其他布尼亚病毒中的功能尚不明确。

二、研究材料与方法

（一）细胞培养

研究选用了多种细胞系，包括埃及伊蚊（Ae. aegypti）胚胎来源的 Aag2 细胞系、白纹伊蚊（Ae. albopictus）幼虫来源的 C6/36 和 U4.4 细胞系，以及哺乳动物细胞系如 BHK - 21、BSR - T7/5、A549 和 A549/NPro 等，并在相应的培养基中培养。

（二）病毒构建与质粒制备

通过反向遗传学技术，构建了布尼亚姆韦拉病毒（BUNV）的野生型（BUNV - wt）、NSm 缺失突变体（BUN - ΔNSm）和 NSm - V5 标签重组体（BUNV - NSmV5）。同时，制备了表达 BUNV NSm 基因的质粒 pPUb - NSm - V5 和 pPUb - NSm。

（三）动物实验

饲养埃及伊蚊 Paea 品系，用于病毒感染实验。通过口服感染和胸腔接种两种方式感染蚊子，口服感染前蚊子需饥饿处理，接种后在特定条件下饲养并于不同时间点取样；胸腔接种则使用 Nanoject II Auto - Nanoliter 注射器将病毒注入蚊子体内。

（四）检测方法

运用病毒滴定、RNA 提取与逆转录定量 PCR（RT - qPCR）、免疫细胞化学等技术检测病毒滴度、RNA 水平和蛋白表达及定位情况。利用系统发育分析探究 NSm 的起源和进化。实验数据采用 GraphPad Prism 9 软件进行统计分析。

三、研究技术路线

研究人员首先通过生物信息学分析，研究 NSm 在不同布尼亚病毒中的分布情况，推测其进化历程。随后，利用细胞系实验，探究 NSm 对病毒在哺乳动物和节肢动物细胞中复制的影响。接着，以埃及伊蚊为模型进行体内实验，通过口服感染和胸腔接种，对比野生型病毒和 NSm 缺失突变体病毒在蚊子体内的感染、传播和扩散情况。进一步通过免疫细胞化学技术，研究 NSm 在感染细胞中的定位。最后，综合各项实验结果，深入分析 NSm 在布尼亚病毒传播过程中的作用机制。

四、研究结果

（一）NSm 仅存在于节肢动物传播的布尼亚病毒中

通过对布尼亚病毒目所有家族和属的生物信息学分析发现，NSm 仅存在于节肢动物传播的布尼亚病毒（虫媒布尼亚病毒）中。系统发育分析表明，NSm 在不同病毒家族中可能是独立多次获得的，在不同家族的病毒中，其基因序列和结构预测存在差异，支持了趋同进化的观点。

（二）NSm 对哺乳动物和节肢动物细胞中的病毒复制并非必需

先前研究表明 BUNV NSm 在哺乳动物 BHK - 21 细胞中对病毒复制并非必需，本研究利用 BUN - ΔNSm 进一步证实了这一点，且发现 NSm 在不同哺乳动物细胞系中均非病毒复制所必需。在蚊子细胞系（Ae. albopictus 幼虫 C6/36 和 U4.4 细胞系、Ae. aegypti 胚胎 Aag2 细胞系）中，BUNV - wt 和 BUN - ΔNSm 的生长曲线无显著差异，说明 NSm 对病毒在蚊子细胞中的复制也非必需。

（三）NSm 是 BUNV 在雌性蚊子体内感染所必需的

给埃及伊蚊喂食感染 BUNV - wt 或 BUN - ΔNSm 的血液后发现，感染 BUNV - wt 的蚊子体内病毒滴度随时间增加，且能扩散到头部；而感染 BUN - ΔNSm 的蚊子头部未检测到病毒，说明其无法扩散。进一步检测中肠和唾液腺等组织的病毒滴度发现，BUN - ΔNSm 在中肠感染效率极低，几乎无法扩散到唾液腺，表明 BUNV NSm 在蚊子体内感染过程中起着关键作用，缺失 NSm 会显著影响病毒在中肠的感染和扩散。

（四）绕过中肠时，NSm 对病毒扩散和传播并非必需

通过胸腔接种感染蚊子，绕过中肠屏障后发现，虽然 BUN - ΔNSm 感染的蚊子中肠病毒滴度低于 BUNV - wt 感染的蚊子，但在唾液腺中，两者病毒滴度无显著差异，且均能产生感染性唾液。免疫染色结果显示，在胸腔接种情况下，两种病毒在唾液腺和血细胞中的感染情况相似，表明绕过中肠后，NSm 对病毒感染和扩散至其他组织并非必需，NSm 的作用具有中肠特异性。

（五）BUN - ΔNSm 能感染中肠细胞但无法形成感染灶

对感染 BUNV - wt 和 BUN - ΔNSm 的蚊子进行早期感染动力学分析，发现 BUN - ΔNSm 在感染早期无法有效感染中肠，虽能进入中肠上皮细胞，但无法从感染细胞传播到未感染细胞，不能形成感染灶，而 BUNV - wt 感染能随时间形成大量感染灶，表明 NSm 缺失导致病毒在中肠的传播受阻。

（六）体内转染表达 NSm 可部分挽救 BUN - ΔNSm 在中肠的感染

向蚊子体内转染表达 BUNV NSm 的质粒 pPUb - NSm - V5 后，感染 BUN - ΔNSm 的蚊子中肠感染率和病毒滴度显著提高，感染灶数量增加，证明 NSm 是 BUNV 在蚊子中肠成功传播感染的关键决定因素。

（七）高剂量的 BUN - ΔNSm 不会增强病毒传播或扩散

给蚊子喂食不同剂量的 BUN - ΔNSm 病毒，虽高剂量组感染蚊子的数量和中肠病毒滴度有所增加，但病毒仍无法在中肠有效传播形成感染灶，也不能扩散到其他组织，说明 BUN - ΔNSm 在中肠遇到的感染和逃逸屏障与剂量无关，NSm 可能是克服病毒与中肠细胞表面结构不相容性的关键。

（八）NSm 在感染细胞的细胞表面和感染灶周边表达

在 BUNV 感染的蚊子细胞和中肠上皮细胞中，NSm 和病毒糖蛋白 Gc 均在细胞表面有定位，且 NSm 主要在感染灶周边表达，在新感染细胞中表达水平较高，与 Gc 在感染细胞的膜区域尤其是三细胞接触处共定位，表明 NSm 在感染细胞中的表达具有时空特异性。

五、研究结论与讨论

本研究表明，NSm 是虫媒布尼亚病毒特有的蛋白，在病毒跨脊椎动物和蚊子宿主传播过程中至关重要。NSm 并非病毒在哺乳动物和蚊子细胞内复制所必需，但对病毒在蚊子中肠的细胞间传播和逃逸中肠屏障、扩散到其他组织起着不可或缺的作用。这一发现填补了人们对布尼亚病毒跨宿主传播机制认知的空白。

研究还发现，增加 BUN - ΔNSm 的感染剂量不能克服其在中肠传播和扩散的障碍，说明 NSm 可能用于克服病毒与中肠细胞表面的结构不相容性。与 TSWV 的 NSm 类似，BUNV 的 NSm 可能通过相似机制促进病毒在中肠上皮细胞间的传播。此外，不同布尼亚病毒家族中 NSm 在细胞间传播的功能可能具有保守性，但部分蜱传布尼亚病毒不编码 NSm，这可能与蜱独特的消化方式和病毒传播特点有关。

该研究成果具有重要的应用价值。在疫苗研发方面，由于减毒活疫苗株应避免在媒介中传播，明确 NSm 作为蚊子感染、传播关键决定因素的功能，有助于开发缺失 NSm 的减毒活疫苗，预防蚊子传播的布尼亚病毒感染，为公共卫生防控提供有力支持。