NSm是布尼亚病毒在脊椎动物和蚊子宿主之间传播的关键决定因素

【字体: 时间:2025年02月01日 来源:Nature Communications

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  布尼亚病毒是一大类病毒,可感染多种生物,包括昆虫、动物、植物和单细胞生物。在这里,Terhzaz等人表明非结构蛋白NSm是蚊子中肠细胞间传播和出口所必需的。

  

布尼亚病毒传播关键蛋白 NSm 的研究解读


格拉斯哥大学医学研究委员会(MRC)- 病毒研究中心的研究人员 Selim Terhzaz、David Kerrigan 等人在《Nature Communications》期刊上发表了题为 “NSm is a critical determinant for bunyavirus transmission between vertebrate and mosquito hosts” 的论文。该研究揭示了布尼亚病毒传播过程中的关键蛋白 NSm 的重要作用,对于理解病毒跨宿主传播机制、开发防控策略意义重大。

一、研究背景


布尼亚病毒目(Bunyavirales)是一类庞大的病毒,可感染节肢动物、脊椎动物、植物和原生动物等多种生物。部分布尼亚病毒经吸血节肢动物在脊椎动物宿主间传播,引发严重人畜疾病,如克里米亚 - 刚果出血热病毒(CCHFV)和裂谷热病毒(RVFV),给全球公共卫生和经济带来沉重负担。由于缺乏疫苗和有效媒介控制措施,加之气候变化影响,此类病毒的威胁日益严峻。

布尼亚病毒虽宿主范围和致病性各异,但具有相似的基因组结构和病毒特征。其基因组为分节段单链 RNA,编码少量蛋白质,在细胞质中复制,在高尔基体膜上组装和出芽。部分布尼亚病毒的 M 节段编码非结构蛋白 NSm,然而除了蓟马传播的番茄斑萎病毒(TSWV)中 NSm 作为运动蛋白参与病毒核糖核蛋白的细胞间运输外,NSm 在其他布尼亚病毒中的功能尚不明确。

二、研究材料与方法


(一)细胞培养


研究选用了多种细胞系,包括埃及伊蚊(Ae. aegypti)胚胎来源的 Aag2 细胞系、白纹伊蚊(Ae. albopictus)幼虫来源的 C6/36 和 U4.4 细胞系,以及哺乳动物细胞系如 BHK - 21、BSR - T7/5、A549 和 A549/NPro 等,并在相应的培养基中培养。

(二)病毒构建与质粒制备


通过反向遗传学技术,构建了布尼亚姆韦拉病毒(BUNV)的野生型(BUNV - wt)、NSm 缺失突变体(BUN - ΔNSm)和 NSm - V5 标签重组体(BUNV - NSmV5)。同时,制备了表达 BUNV NSm 基因的质粒 pPUb - NSm - V5 和 pPUb - NSm。

(三)动物实验


饲养埃及伊蚊 Paea 品系,用于病毒感染实验。通过口服感染和胸腔接种两种方式感染蚊子,口服感染前蚊子需饥饿处理,接种后在特定条件下饲养并于不同时间点取样;胸腔接种则使用 Nanoject II Auto - Nanoliter 注射器将病毒注入蚊子体内。

(四)检测方法


运用病毒滴定、RNA 提取与逆转录定量 PCR(RT - qPCR)、免疫细胞化学等技术检测病毒滴度、RNA 水平和蛋白表达及定位情况。利用系统发育分析探究 NSm 的起源和进化。实验数据采用 GraphPad Prism 9 软件进行统计分析。

三、研究技术路线


研究人员首先通过生物信息学分析,研究 NSm 在不同布尼亚病毒中的分布情况,推测其进化历程。随后,利用细胞系实验,探究 NSm 对病毒在哺乳动物和节肢动物细胞中复制的影响。接着,以埃及伊蚊为模型进行体内实验,通过口服感染和胸腔接种,对比野生型病毒和 NSm 缺失突变体病毒在蚊子体内的感染、传播和扩散情况。进一步通过免疫细胞化学技术,研究 NSm 在感染细胞中的定位。最后,综合各项实验结果,深入分析 NSm 在布尼亚病毒传播过程中的作用机制。

四、研究结果


(一)NSm 仅存在于节肢动物传播的布尼亚病毒中


通过对布尼亚病毒目所有家族和属的生物信息学分析发现,NSm 仅存在于节肢动物传播的布尼亚病毒(虫媒布尼亚病毒)中。系统发育分析表明,NSm 在不同病毒家族中可能是独立多次获得的,在不同家族的病毒中,其基因序列和结构预测存在差异,支持了趋同进化的观点。

(二)NSm 对哺乳动物和节肢动物细胞中的病毒复制并非必需


先前研究表明 BUNV NSm 在哺乳动物 BHK - 21 细胞中对病毒复制并非必需,本研究利用 BUN - ΔNSm 进一步证实了这一点,且发现 NSm 在不同哺乳动物细胞系中均非病毒复制所必需。在蚊子细胞系(Ae. albopictus 幼虫 C6/36 和 U4.4 细胞系、Ae. aegypti 胚胎 Aag2 细胞系)中,BUNV - wt 和 BUN - ΔNSm 的生长曲线无显著差异,说明 NSm 对病毒在蚊子细胞中的复制也非必需。

(三)NSm 是 BUNV 在雌性蚊子体内感染所必需的


给埃及伊蚊喂食感染 BUNV - wt 或 BUN - ΔNSm 的血液后发现,感染 BUNV - wt 的蚊子体内病毒滴度随时间增加,且能扩散到头部;而感染 BUN - ΔNSm 的蚊子头部未检测到病毒,说明其无法扩散。进一步检测中肠和唾液腺等组织的病毒滴度发现,BUN - ΔNSm 在中肠感染效率极低,几乎无法扩散到唾液腺,表明 BUNV NSm 在蚊子体内感染过程中起着关键作用,缺失 NSm 会显著影响病毒在中肠的感染和扩散。

(四)绕过中肠时,NSm 对病毒扩散和传播并非必需


通过胸腔接种感染蚊子,绕过中肠屏障后发现,虽然 BUN - ΔNSm 感染的蚊子中肠病毒滴度低于 BUNV - wt 感染的蚊子,但在唾液腺中,两者病毒滴度无显著差异,且均能产生感染性唾液。免疫染色结果显示,在胸腔接种情况下,两种病毒在唾液腺和血细胞中的感染情况相似,表明绕过中肠后,NSm 对病毒感染和扩散至其他组织并非必需,NSm 的作用具有中肠特异性。

(五)BUN - ΔNSm 能感染中肠细胞但无法形成感染灶


对感染 BUNV - wt 和 BUN - ΔNSm 的蚊子进行早期感染动力学分析,发现 BUN - ΔNSm 在感染早期无法有效感染中肠,虽能进入中肠上皮细胞,但无法从感染细胞传播到未感染细胞,不能形成感染灶,而 BUNV - wt 感染能随时间形成大量感染灶,表明 NSm 缺失导致病毒在中肠的传播受阻。

(六)体内转染表达 NSm 可部分挽救 BUN - ΔNSm 在中肠的感染


向蚊子体内转染表达 BUNV NSm 的质粒 pPUb - NSm - V5 后,感染 BUN - ΔNSm 的蚊子中肠感染率和病毒滴度显著提高,感染灶数量增加,证明 NSm 是 BUNV 在蚊子中肠成功传播感染的关键决定因素。

(七)高剂量的 BUN - ΔNSm 不会增强病毒传播或扩散


给蚊子喂食不同剂量的 BUN - ΔNSm 病毒,虽高剂量组感染蚊子的数量和中肠病毒滴度有所增加,但病毒仍无法在中肠有效传播形成感染灶,也不能扩散到其他组织,说明 BUN - ΔNSm 在中肠遇到的感染和逃逸屏障与剂量无关,NSm 可能是克服病毒与中肠细胞表面结构不相容性的关键。

(八)NSm 在感染细胞的细胞表面和感染灶周边表达


在 BUNV 感染的蚊子细胞和中肠上皮细胞中,NSm 和病毒糖蛋白 Gc 均在细胞表面有定位,且 NSm 主要在感染灶周边表达,在新感染细胞中表达水平较高,与 Gc 在感染细胞的膜区域尤其是三细胞接触处共定位,表明 NSm 在感染细胞中的表达具有时空特异性。

五、研究结论与讨论


本研究表明,NSm 是虫媒布尼亚病毒特有的蛋白,在病毒跨脊椎动物和蚊子宿主传播过程中至关重要。NSm 并非病毒在哺乳动物和蚊子细胞内复制所必需,但对病毒在蚊子中肠的细胞间传播和逃逸中肠屏障、扩散到其他组织起着不可或缺的作用。这一发现填补了人们对布尼亚病毒跨宿主传播机制认知的空白。

研究还发现,增加 BUN - ΔNSm 的感染剂量不能克服其在中肠传播和扩散的障碍,说明 NSm 可能用于克服病毒与中肠细胞表面的结构不相容性。与 TSWV 的 NSm 类似,BUNV 的 NSm 可能通过相似机制促进病毒在中肠上皮细胞间的传播。此外,不同布尼亚病毒家族中 NSm 在细胞间传播的功能可能具有保守性,但部分蜱传布尼亚病毒不编码 NSm,这可能与蜱独特的消化方式和病毒传播特点有关。

该研究成果具有重要的应用价值。在疫苗研发方面,由于减毒活疫苗株应避免在媒介中传播,明确 NSm 作为蚊子感染、传播关键决定因素的功能,有助于开发缺失 NSm 的减毒活疫苗,预防蚊子传播的布尼亚病毒感染,为公共卫生防控提供有力支持。

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