组蛋白乳酸化通过与PTEN形成正反馈回路促进肝癌多药耐药

　　

组蛋白乳酸化与肝癌多药耐药的研究新进展

温州医科大学附属第一医院消化内科的 Yuan Zeng 等人在《Cell Death and Disease》期刊上发表了题为 “Histone lactylation promotes multidrug resistance in hepatocellular carcinoma by forming a positive feedback loop with PTEN” 的论文。该研究揭示了肝癌细胞对奥沙利铂（OXA）和 5 - 氟尿嘧啶（5-Fu）耐药的新机制，为克服临床化疗耐药提供了潜在的治疗靶点，在肝癌治疗领域具有重要意义。

一、研究背景

肝癌是全球癌症相关死亡的主要原因之一，肝细胞癌（HCC）作为原发性肝癌的最常见类型，是癌症相关死亡的第三大原因。肝动脉灌注化疗（HAIC）中使用的奥沙利铂、氟尿嘧啶和亚叶酸（FOLFOX）方案虽广泛应用于 HCC 患者，但耐药问题严重限制了其疗效。因此，明确奥沙利铂和 5 - 氟尿嘧啶耐药的分子机制对改善 HCC 患者预后至关重要。

肿瘤细胞的有氧糖酵解（Warburg 效应）与多种恶性行为相关，且乳酸衍生的组蛋白赖氨酸乳酸化是一种新型表观遗传修饰，可直接增加染色质内的基因转录。神经元前体细胞表达发育下调蛋白 4（NEDD4）作为 HECT 结构域 E3 连接酶家族的重要成员，在肿瘤细胞的多种过程中发挥关键作用，但 NEDD4 是否参与奥沙利铂和 5 - 氟尿嘧啶耐药的 HCC 发展尚不明确。

二、研究材料与方法

1. 细胞系与培养条件：使用人 HCC-LM3 和 Huh7 细胞，来源于中国科学院细胞库，在添加 10% 胎牛血清和 1% 青霉素 / 链霉素的 DMEM 培养基中，于 37°C、5% CO?培养箱中培养，实验前对细胞进行 STR 鉴定并确保无支原体污染。
2. 耐药细胞系的建立：通过逐步增加奥沙利铂或 5 - 氟尿嘧啶浓度的方法，分别诱导建立奥沙利铂耐药（Lm3-Res 和 Huh7-Res）和 5 - 氟尿嘧啶耐药（Lm3Res 和 Huh7-Res）的 HCC 细胞系。
3. 体内裸鼠模型的建立：将 40 只 4 周龄 BALB/c 裸鼠（雌雄各 20 只）随机分组，通过皮下注射奥沙利铂耐药的 Lm3 OE-NEDD4 或 OE-NC 细胞建立小鼠肿瘤模型，后续进行不同处理，记录肿瘤生长情况，实验结束后对肿瘤组织进行相关检测。
4. 实验技术：运用定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）检测基因表达水平；采用蛋白质免疫印迹（Western blot）分析蛋白表达；利用细胞活力检测（CCK8 实验）测定药物半数抑制浓度（IC50）；借助免疫荧光实验观察蛋白定位与共定位；通过 Transwell 实验评估细胞迁移能力；运用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）探究组蛋白修饰与基因的关系。

三、研究结果

1. 奥沙利铂耐药 HCC 细胞中组蛋白乳酸化增加：构建奥沙利铂耐药细胞系后，CCK8 实验表明其 IC50 显著升高。qRT-PCR 和 Western blot 分析显示，耐药细胞中糖酵解相关酶的 mRNA 和蛋白水平显著增加，细胞内乳酸水平也明显上升，且组蛋白乳酸化水平升高，主要发生在细胞核内，其中 H3K14la 蛋白水平显著增加，而 H3K15a 蛋白水平无明显变化。此外，研究发现活性氧（ROS）积累在耐药过程中未促进 H3K14la 表达，提示组蛋白乳酸化增加的具体机制有待进一步研究。
2. 抑制组蛋白乳酸化抑制奥沙利铂耐药细胞的进展：使用 2 - 脱氧 - D - 葡萄糖（2DG）、草氨酸盐（oxamate）、si-LDHA 和 si-LDHB 处理细胞，可降低细胞内乳酸和组蛋白乳酸化水平。功能实验显示，抑制组蛋白乳酸化后，奥沙利铂耐药细胞的迁移、增殖、干细胞特性等恶性行为受到抑制，同时增加了对奥沙利铂化疗的敏感性。
3. 组蛋白乳酸化调节奥沙利铂耐药菌株中的泛素化：通过对奥沙利铂耐药 Lm3 细胞进行 ChIP-seq 及后续的 GO 和 KEGG 分析，发现组蛋白乳酸化主要参与调节细胞内泛素化过程。进一步研究证实，E3 泛素连接酶 NEDD4 的表达受组蛋白乳酸化正调控，H3K14la 信号在 NEDD4 基因启动子区域显著富集，抑制组蛋白乳酸化可降低 NEDD4 蛋白水平。
4. 组蛋白乳酸化通过 NEDD4 介导奥沙利铂耐药菌株的恶性进展：对 NEDD4 在 HCC 细胞中的功能研究发现，沉默 NEDD4 表达可显著抑制奥沙利铂耐药细胞的增殖。过表达 NEDD4 可逆转因抑制组蛋白乳酸化而导致的肿瘤抑制作用，表明组蛋白乳酸化部分通过 NEDD4 发挥促肿瘤作用。
5. NEDD4 诱导的 PTEN 泛素化介导 HCC 细胞的奥沙利铂耐药：研究表明，NEDD4 参与调节奥沙利铂耐药细胞中 PTEN 的泛素化和蛋白酶体降解过程。奥沙利铂耐药细胞中 PTEN 蛋白水平降低，NEDD4 与 PTEN 的共定位和结合增加，抑制组蛋白乳酸化可阻断这一过程。此外，PTEN 的减少激活了 PI3K/Akt/mTOR 信号通路，促进了肿瘤细胞的耐药性。
6. 组蛋白乳酸化通过 NEDD4 诱导的 PTEN 泛素化介导 5 - 氟尿嘧啶耐药：构建 5 - 氟尿嘧啶耐药细胞系后发现，其具有活跃的乳酸产生，组蛋白乳酸化和 NEDD4 蛋白水平升高，PTEN 蛋白水平降低。免疫荧光和 Co-IP 实验表明，5 - 氟尿嘧啶耐药细胞中 NEDD4 与 PTEN 的结合和 PTEN 泛素化水平增加，说明组蛋白乳酸化在 5 - 氟尿嘧啶耐药中也发挥重要作用。
7. 糖酵解 / H3K14la/PTEN 在奥沙利铂和 5 - 氟尿嘧啶耐药的 HCC 中形成正反馈回路：在奥沙利铂和 5 - 氟尿嘧啶耐药细胞中过表达 PTEN，可显著降低细胞内乳酸水平，下调糖酵解相关基因和蛋白的表达，同时降低 PKla、H3K14la 和 NEDD4 的水平，表明恢复 PTEN 水平可打破正反馈回路。
8. 组蛋白乳酸化通过 NEDD4/PTEN 在体内调节奥沙利铂耐药：构建裸鼠异种移植瘤模型，结果显示，添加组蛋白乳酸化抑制剂 oxamate 可显著减小肿瘤体积，而 OE-NEDD4 则使肿瘤体积增大。体内实验进一步证实了组蛋白乳酸化 / NEDD4/PTEN 轴在奥沙利铂耐药中的重要调节作用，且该作用与性别无关。

四、研究结论

该研究表明，在奥沙利铂和 5 - 氟尿嘧啶耐药的 HCC 细胞中，细胞内乳酸化水平升高，以组蛋白乳酸化的形式发挥调节作用。H3K14la 调节 NEDD4 的表达，进而促进 PTEN 的泛素化和降解。PTEN 的减少激活了 PI3K/Akt/mTOR 信号通路，诱导了 HCC 的化疗耐药。同时，PTEN 的降解减轻了对细胞内糖酵解的抑制，增加了糖酵解活性，形成了正反馈回路。抑制细胞内组蛋白乳酸化可有效抑制奥沙利铂和 5 - 氟尿嘧啶耐药细胞的恶性进展，提高 HCC 细胞对化疗的敏感性。

五、讨论

FOLFOX 方案是 HCC 的常用治疗方法，但耐药问题限制了其疗效。本研究发现耐药细胞的糖酵解活性增强，且糖酵解产物乳酸通过组蛋白乳酸化增强 HCC 的耐药性。组蛋白乳酸化增强 NEDD4 的表达，NEDD4 与 PTEN 相互作用促进 PTEN 的泛素化和降解，最终导致奥沙利铂和 5 - 氟尿嘧啶耐药。这一机制在 5 - 氟尿嘧啶耐药细胞系中也相似，表明组蛋白乳酸化在 HCC 多药耐药中可能起重要作用。使用组蛋白乳酸化抑制剂可使细胞对 HCC 化疗敏感，为临床治疗耐药患者提供了新途径。

然而，该研究存在一定局限性。缺乏临床样本支持和临床试验补充，未构建 FOLFOX 耐药的 HCC 细胞系，也未使用商业多验证的耐药菌株。乳酸代谢功能的生物学效应不能完全排除，奥沙利铂和 5 - 氟尿嘧啶耐药细胞中是否存在其他作用机制、NEDD4 的其他靶点是否发挥作用以及 NEDD4 与乳酸化修饰的因果关系等仍有待进一步研究。此外，H3K14la 调节 NEDD4 的机制及其在启动子上的结合位点也需深入探究。

总体而言，该研究揭示了肝癌对奥沙利铂和 5 - 氟尿嘧啶耐药的新机制，为肝癌的治疗提供了潜在的治疗靶点和新的研究方向，有助于推动肝癌临床治疗的发展。