组蛋白乳酸化通过与PTEN形成正反馈回路促进肝癌多药耐药

【字体: 时间:2025年02月01日 来源:Cell Death & Disease 8.1

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组蛋白乳酸化与肝癌多药耐药的研究新进展


温州医科大学附属第一医院消化内科的 Yuan Zeng 等人在《Cell Death and Disease》期刊上发表了题为 “Histone lactylation promotes multidrug resistance in hepatocellular carcinoma by forming a positive feedback loop with PTEN” 的论文。该研究揭示了肝癌细胞对奥沙利铂(OXA)和 5 - 氟尿嘧啶(5-Fu)耐药的新机制,为克服临床化疗耐药提供了潜在的治疗靶点,在肝癌治疗领域具有重要意义。

一、研究背景


肝癌是全球癌症相关死亡的主要原因之一,肝细胞癌(HCC)作为原发性肝癌的最常见类型,是癌症相关死亡的第三大原因。肝动脉灌注化疗(HAIC)中使用的奥沙利铂、氟尿嘧啶和亚叶酸(FOLFOX)方案虽广泛应用于 HCC 患者,但耐药问题严重限制了其疗效。因此,明确奥沙利铂和 5 - 氟尿嘧啶耐药的分子机制对改善 HCC 患者预后至关重要。

肿瘤细胞的有氧糖酵解(Warburg 效应)与多种恶性行为相关,且乳酸衍生的组蛋白赖氨酸乳酸化是一种新型表观遗传修饰,可直接增加染色质内的基因转录。神经元前体细胞表达发育下调蛋白 4(NEDD4)作为 HECT 结构域 E3 连接酶家族的重要成员,在肿瘤细胞的多种过程中发挥关键作用,但 NEDD4 是否参与奥沙利铂和 5 - 氟尿嘧啶耐药的 HCC 发展尚不明确。

二、研究材料与方法


  1. 细胞系与培养条件:使用人 HCC-LM3 和 Huh7 细胞,来源于中国科学院细胞库,在添加 10% 胎牛血清和 1% 青霉素 / 链霉素的 DMEM 培养基中,于 37°C、5% CO?培养箱中培养,实验前对细胞进行 STR 鉴定并确保无支原体污染。
  2. 耐药细胞系的建立:通过逐步增加奥沙利铂或 5 - 氟尿嘧啶浓度的方法,分别诱导建立奥沙利铂耐药(Lm3-Res 和 Huh7-Res)和 5 - 氟尿嘧啶耐药(Lm3Res 和 Huh7-Res)的 HCC 细胞系。
  3. 体内裸鼠模型的建立:将 40 只 4 周龄 BALB/c 裸鼠(雌雄各 20 只)随机分组,通过皮下注射奥沙利铂耐药的 Lm3 OE-NEDD4 或 OE-NC 细胞建立小鼠肿瘤模型,后续进行不同处理,记录肿瘤生长情况,实验结束后对肿瘤组织进行相关检测。
  4. 实验技术:运用定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)检测基因表达水平;采用蛋白质免疫印迹(Western blot)分析蛋白表达;利用细胞活力检测(CCK8 实验)测定药物半数抑制浓度(IC50);借助免疫荧光实验观察蛋白定位与共定位;通过 Transwell 实验评估细胞迁移能力;运用染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)探究组蛋白修饰与基因的关系。

三、研究结果


  1. 奥沙利铂耐药 HCC 细胞中组蛋白乳酸化增加:构建奥沙利铂耐药细胞系后,CCK8 实验表明其 IC50 显著升高。qRT-PCR 和 Western blot 分析显示,耐药细胞中糖酵解相关酶的 mRNA 和蛋白水平显著增加,细胞内乳酸水平也明显上升,且组蛋白乳酸化水平升高,主要发生在细胞核内,其中 H3K14la 蛋白水平显著增加,而 H3K15a 蛋白水平无明显变化。此外,研究发现活性氧(ROS)积累在耐药过程中未促进 H3K14la 表达,提示组蛋白乳酸化增加的具体机制有待进一步研究。
  2. 抑制组蛋白乳酸化抑制奥沙利铂耐药细胞的进展:使用 2 - 脱氧 - D - 葡萄糖(2DG)、草氨酸盐(oxamate)、si-LDHA 和 si-LDHB 处理细胞,可降低细胞内乳酸和组蛋白乳酸化水平。功能实验显示,抑制组蛋白乳酸化后,奥沙利铂耐药细胞的迁移、增殖、干细胞特性等恶性行为受到抑制,同时增加了对奥沙利铂化疗的敏感性。
  3. 组蛋白乳酸化调节奥沙利铂耐药菌株中的泛素化:通过对奥沙利铂耐药 Lm3 细胞进行 ChIP-seq 及后续的 GO 和 KEGG 分析,发现组蛋白乳酸化主要参与调节细胞内泛素化过程。进一步研究证实,E3 泛素连接酶 NEDD4 的表达受组蛋白乳酸化正调控,H3K14la 信号在 NEDD4 基因启动子区域显著富集,抑制组蛋白乳酸化可降低 NEDD4 蛋白水平。
  4. 组蛋白乳酸化通过 NEDD4 介导奥沙利铂耐药菌株的恶性进展:对 NEDD4 在 HCC 细胞中的功能研究发现,沉默 NEDD4 表达可显著抑制奥沙利铂耐药细胞的增殖。过表达 NEDD4 可逆转因抑制组蛋白乳酸化而导致的肿瘤抑制作用,表明组蛋白乳酸化部分通过 NEDD4 发挥促肿瘤作用。
  5. NEDD4 诱导的 PTEN 泛素化介导 HCC 细胞的奥沙利铂耐药:研究表明,NEDD4 参与调节奥沙利铂耐药细胞中 PTEN 的泛素化和蛋白酶体降解过程。奥沙利铂耐药细胞中 PTEN 蛋白水平降低,NEDD4 与 PTEN 的共定位和结合增加,抑制组蛋白乳酸化可阻断这一过程。此外,PTEN 的减少激活了 PI3K/Akt/mTOR 信号通路,促进了肿瘤细胞的耐药性。
  6. 组蛋白乳酸化通过 NEDD4 诱导的 PTEN 泛素化介导 5 - 氟尿嘧啶耐药:构建 5 - 氟尿嘧啶耐药细胞系后发现,其具有活跃的乳酸产生,组蛋白乳酸化和 NEDD4 蛋白水平升高,PTEN 蛋白水平降低。免疫荧光和 Co-IP 实验表明,5 - 氟尿嘧啶耐药细胞中 NEDD4 与 PTEN 的结合和 PTEN 泛素化水平增加,说明组蛋白乳酸化在 5 - 氟尿嘧啶耐药中也发挥重要作用。
  7. 糖酵解 / H3K14la/PTEN 在奥沙利铂和 5 - 氟尿嘧啶耐药的 HCC 中形成正反馈回路:在奥沙利铂和 5 - 氟尿嘧啶耐药细胞中过表达 PTEN,可显著降低细胞内乳酸水平,下调糖酵解相关基因和蛋白的表达,同时降低 PKla、H3K14la 和 NEDD4 的水平,表明恢复 PTEN 水平可打破正反馈回路。
  8. 组蛋白乳酸化通过 NEDD4/PTEN 在体内调节奥沙利铂耐药:构建裸鼠异种移植瘤模型,结果显示,添加组蛋白乳酸化抑制剂 oxamate 可显著减小肿瘤体积,而 OE-NEDD4 则使肿瘤体积增大。体内实验进一步证实了组蛋白乳酸化 / NEDD4/PTEN 轴在奥沙利铂耐药中的重要调节作用,且该作用与性别无关。

四、研究结论


该研究表明,在奥沙利铂和 5 - 氟尿嘧啶耐药的 HCC 细胞中,细胞内乳酸化水平升高,以组蛋白乳酸化的形式发挥调节作用。H3K14la 调节 NEDD4 的表达,进而促进 PTEN 的泛素化和降解。PTEN 的减少激活了 PI3K/Akt/mTOR 信号通路,诱导了 HCC 的化疗耐药。同时,PTEN 的降解减轻了对细胞内糖酵解的抑制,增加了糖酵解活性,形成了正反馈回路。抑制细胞内组蛋白乳酸化可有效抑制奥沙利铂和 5 - 氟尿嘧啶耐药细胞的恶性进展,提高 HCC 细胞对化疗的敏感性。

五、讨论


FOLFOX 方案是 HCC 的常用治疗方法,但耐药问题限制了其疗效。本研究发现耐药细胞的糖酵解活性增强,且糖酵解产物乳酸通过组蛋白乳酸化增强 HCC 的耐药性。组蛋白乳酸化增强 NEDD4 的表达,NEDD4 与 PTEN 相互作用促进 PTEN 的泛素化和降解,最终导致奥沙利铂和 5 - 氟尿嘧啶耐药。这一机制在 5 - 氟尿嘧啶耐药细胞系中也相似,表明组蛋白乳酸化在 HCC 多药耐药中可能起重要作用。使用组蛋白乳酸化抑制剂可使细胞对 HCC 化疗敏感,为临床治疗耐药患者提供了新途径。

然而,该研究存在一定局限性。缺乏临床样本支持和临床试验补充,未构建 FOLFOX 耐药的 HCC 细胞系,也未使用商业多验证的耐药菌株。乳酸代谢功能的生物学效应不能完全排除,奥沙利铂和 5 - 氟尿嘧啶耐药细胞中是否存在其他作用机制、NEDD4 的其他靶点是否发挥作用以及 NEDD4 与乳酸化修饰的因果关系等仍有待进一步研究。此外,H3K14la 调节 NEDD4 的机制及其在启动子上的结合位点也需深入探究。

总体而言,该研究揭示了肝癌对奥沙利铂和 5 - 氟尿嘧啶耐药的新机制,为肝癌的治疗提供了潜在的治疗靶点和新的研究方向,有助于推动肝癌临床治疗的发展。

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