trim21介导的PRMT1降解减缓结直肠癌的恶性进展

　　

探索 TRIM21 与 PRMT1 的关联：为结直肠癌治疗带来新曙光

来自南京医科大学、徐州医科大学等多单位的研究人员，以 Menghan Cao、Zhiying Shao 等人为代表，在《Cell Death and Disease》期刊上发表了题为 “TRIM21-mediated PRMT1 degradation attenuates colorectal cancer malignant progression” 的论文。该研究揭示了 TRIM21 在结直肠癌（CRC）发展中的关键作用，为 CRC 的预后评估和治疗提供了新的方向，在肿瘤研究领域具有重要意义。

一、研究背景

（一）结直肠癌的现状

结直肠癌在全球恶性肿瘤发病率和死亡率中位列第三，每年新发病例和死亡人数众多。然而，其发病机制尚未完全明确，这极大地阻碍了诊断和治疗工作的开展。深入探究结直肠癌发生发展的调控机制，对实现更有效的诊断、预后评估和治疗至关重要。

（二）TRIM21 的作用

TRIM21 属于 TRIM 家族，其基因位于 11 号染色体，编码的蛋白具有 RING 依赖的 E3 连接酶活性，在细胞质和细胞核中均有表达。TRIM21 参与炎症、癌症发展和自身免疫疾病等过程，在不同癌症中发挥着不同作用，在乳腺癌、肾癌和宫颈癌等中起抑癌作用，而在胶质瘤、鼻咽癌和肝癌等中却促进肿瘤生长。在结直肠癌中，TRIM21 的作用存在争议，其与结直肠癌细胞干性和转移潜能降低相关，但又参与化疗耐药和肿瘤发生，具体机制有待进一步明确。

（三）PRMT1 的研究现状

精氨酸甲基化是真核生物中常见的翻译后修饰，由蛋白精氨酸甲基转移酶（PRMTs）催化。PRMT1 是主要的 I 型 PRMT，负责哺乳动物中 85% 的 I 型 PRMT 活性，在转录调控、信号转导和 DNA 损伤修复等细胞过程中发挥关键作用。PRMT1 催化形成的不对称二甲基精氨酸（ADMAs）参与肿瘤发生和转移，是潜在的药物靶点，但目前针对 PRMT1 的特异性抑制剂在临床试验中效果不佳，且对其调控机制，尤其是蛋白质稳定性的调控了解有限。

二、研究材料与方法

（一）患者及样本收集

研究人员收集了 2005 年至 2008 年徐州医科大学附属医院的 485 对结直肠癌组织样本，并从医院病历获取患者的临床病理信息，计算患者的总生存期（OS）和疾病特异性生存期（DSS）。

（二）细胞培养与处理

实验使用的 HEK293T 和结直肠癌细胞系购自中国科学院细胞库，在添加 10% 胎牛血清、100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素的 DMEM 培养基中，于 37°C、5% CO?的培养箱中培养。通过转染针对 TRIM21 的小干扰 RNA（siRNAs）敲低 TRIM21 表达，以非特异性 siRNA 作为阴性对照；利用 Lipofectamine 2000 进行质粒转染。

（三）实验技术与检测方法

运用蛋白质免疫印迹（Western blot）分析检测相关蛋白表达，使用的抗体包括针对 TRIM21、PRMT1 等多种蛋白的特异性抗体。构建稳定细胞系时，采用慢病毒包装和转染技术获得稳定转染的 HCT-116 细胞系。提取 RNA 并进行逆转录 PCR 和 qRT-PCR，以检测基因表达。在动物实验中，选用 BALB/c 裸鼠构建皮下肿瘤模型和肺转移模型，评估肿瘤生长和转移情况。采用免疫组织化学（IHC）染色检测组织中蛋白表达。通过细胞计数试剂盒 - 8（CCK-8）、Transwell 迁移实验、侵袭实验和伤口愈合实验分别检测细胞增殖、迁移和侵袭能力。

三、研究技术路线

研究人员首先通过数据库分析和组织芯片免疫组化染色，探究 TRIM21 在结直肠癌组织中的表达情况及其与患者临床病理特征和生存的相关性。接着，在细胞水平进行 TRIM21 的敲低和过表达实验，利用 CCK-8、克隆形成实验、Transwell 实验等检测对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响，并通过 Western blot 分析相关细胞周期蛋白和上皮 - 间质转化（EMT）标志物的表达变化。为了探究 TRIM21 的作用机制，通过质谱分析筛选其潜在下游靶点，利用 Co-IP 实验验证 TRIM21 与 PRMT1 的相互作用，通过 Western blot 和 qPCR 检测 PRMT1 的蛋白和 mRNA 水平变化，使用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）检测 PRMT1 蛋白的降解速率。进一步通过引入 Flag-PRMT1 质粒、添加蛋白酶体抑制剂 MG132 以及构建 TRIM21 结构域截断突变体等实验，明确 TRIM21 对 PRMT1 的泛素化修饰方式及关键作用结构域。在体内实验中，构建裸鼠皮下肿瘤模型和肺转移模型，观察 TRIM21 和 PRMT1 对肿瘤生长和转移的影响。

四、研究结果

（一）低 TRIM21 表达与 CRC 患者临床病理参数和不良生存相关

利用 CPTAC 数据库分析发现，结直肠癌组织中 TRIM21 表达显著低于正常组织。对 427 对结直肠癌组织和癌旁组织进行 IHC 染色，结果进一步证实了这一发现。通过 Fisher 精确检验分析 TRIM21 表达与临床病理特征的相关性，发现低 TRIM21 表达与肿瘤直径大、分化差、淋巴结转移、远处转移和晚期 TNM 分期显著相关，但与年龄和性别无关。Kaplan-Meier 生存分析和 log-rank 检验表明，低 TRIM21 表达的患者总生存期和疾病特异性生存期更差。单因素和多因素 Cox 回归分析显示，TRIM21 表达是 CRC 患者总生存期和疾病特异性生存期的独立预后生物标志物。

（二）TRIM21 在体外抑制 CRC 细胞的增殖和运动能力

在 HCT116 和 LoVo 细胞中进行 TRIM21 的敲低和过表达实验，CCK-8 和克隆形成实验结果显示，敲低 TRIM21 促进细胞增殖，而过表达 TRIM21 抑制细胞增殖。Western blot 分析表明，TRIM21 缺失导致细胞周期蛋白 cyclin E2 和 cyclin D1 水平升高，p21 水平降低；TRIM21 过表达则产生相反结果。Transwell 实验显示，敲低 TRIM21 促进 CRC 细胞的迁移和侵袭能力，过表达 TRIM21 则抑制这些能力。同时，TRIM21 缺失使 EMT 标志物 N-cadherin 和 Snail 水平升高，E-cadherin 水平降低；TRIM21 过表达时结果相反。

（三）TRIM21 与 PRMT1 结合并降低其蛋白质稳定性

在 HCT-116 细胞中转染对照载体质粒和 TRIM21 过表达质粒，通过质谱分析筛选出 PRMT1 作为 TRIM21 的潜在下游靶点。Co-IP 实验证实了 HCT-116 和 LoVo 细胞中内源性 TRIM21 和 PRMT1 的相互结合。Western blot 实验表明，TRIM21 负向调节 PRMT1 的蛋白质水平，但对其 mRNA 水平无显著影响。用 CHX 处理 HCT-116 细胞后发现，TRIM21 过表达组 PRMT1 蛋白的降解速率更快，半衰期缩短，说明 TRIM21 降低了 PRMT1 在 CRC 细胞中的稳定性。

（四）TRIM21 介导 CRC 细胞中 PRMT1 的 K48 连接的泛素化降解

在 HCT-116 和 LoVo 细胞中引入 Flag-PRMT1 质粒并转染对照质粒和 TRIM21 过表达质粒，Co-IP 分析显示，TRIM21 过表达组 PRMT1 的泛素化水平显著升高，添加 MG132 后，TRIM21 对 PRMT1 蛋白水平的下调作用被逆转，表明 TRIM21 通过泛素 - 蛋白酶体途径调节 PRMT1 的蛋白质稳定性。构建多种 TRIM21 结构域截断突变体，发现缺失 SPRY 结构域的突变体与 PRMT1 的相互作用能力受损，说明 SPRY 结构域是 TRIM21 与 PRMT1 相互作用的主要区域。Co-IP 实验证实 TRIM21 主要诱导 PRMT1 的 K48 连接的泛素化。

（五）PRMT1 是 TRIM21 介导的 CRC 进展体外抑制所必需的

在四组 HCT-116 细胞中进行实验，CCK-8 和克隆形成实验结果表明，PRMT1 过表达促进细胞增殖，TRIM21 过表达抑制细胞增殖，而在同时过表达 TRIM21 和 PRMT1 的细胞中，PRMT1 过表达可逆转 TRIM21 对细胞增殖的抑制作用。Western blot 实验显示，过表达 TRIM21 使 HCT-116 细胞中 p16 和 p21 水平显著升高，而 PRMT1 过表达减弱了这种升高。Transwell 实验表明，TRIM21 过表达抑制细胞迁移和侵袭，PRMT1 过表达促进这些过程，在过表达 TRIM21 的细胞中，PRMT1 过表达可恢复细胞的迁移能力。

（六）TRIM21 在体内以 PRMT1 依赖的方式影响 CRC 的发展

在裸鼠皮下肿瘤模型中，OE-TRIM21 组肿瘤重量和体积显著低于对照组，OE-PRMT1 组则较高，在 OE-TRIM21 组中恢复 PRMT1 表达可逆转 TRIM21 的抑瘤作用。IHC 染色显示，相应组中 TRIM21 和 PRMT1 稳定过表达，OE-TRIM21 组 Ki67 阳性细胞数显著低于对照组，OE-PRMT1 组较高，OE-TRIM21 + OE-PRMT1 组 Ki67 阳性细胞数比 OE-TRIM21 组显著增加。在肺转移模型中，OE-TRIM21 组肺内转移结节数显著少于对照组，OE-PRMT1 组增加，OE-TRIM21 + OE-PRMT1 组比 OE-TRIM21 组转移结节数显著增多。

五、研究结论

本研究发现，TRIM21 在结直肠癌组织中表达降低，低表达的 TRIM21 与不良临床病理特征和较短生存期相关，是结直肠癌患者独立的预后生物标志物。机制上，TRIM21 通过其 SPRY 结构域与 PRMT1 结合，作为 E3 泛素连接酶促进 PRMT1 的 K48 连接的泛素化和降解，进而抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。体内实验也证实，TRIM21 以 PRMT1 依赖的方式抑制结直肠癌的发生和转移。

六、讨论

结直肠癌发病率持续上升，尽管有新的治疗方法出现，但治愈率仍未显著提高，死亡率居高不下。早期诊断困难导致多数患者确诊时已处于晚期，因此寻找敏感、特异性的生物标志物和有效治疗靶点至关重要。本研究首次揭示了 TRIM21 在结直肠癌中的抑癌作用及其通过调节 PRMT1 发挥作用的机制，为理解结直肠癌的发病机制提供了新视角。同时，该研究为抗 PRMT1 治疗面临的挑战提供了潜在解决方案，提示开发特异性激活 TRIM21 的靶向药物可能成为治疗结直肠癌的有效策略，为临床干预开辟了新途径。不过，TRIM21 与 PRMT1 相互作用的下游靶点和通路仍有待进一步研究，这将有助于更深入地了解结直肠癌的发展机制，为未来的治疗提供更精准的方向。