肝细胞中Smad4缺乏通过抑制脂肪生成和巨噬细胞极化来减缓NAFLD的进展

　　

肝细胞中 Smad4 缺失通过抑制脂肪生成和巨噬细胞极化减缓非酒精性脂肪性肝病进展

北京交通大学生命科学与生物工程学院等单位的研究人员 Wei Yang、Xuanxuan Yan 等在《Cell Death and Disease》期刊上发表了题为 “Smad4 deficiency in hepatocytes attenuates NAFLD progression via inhibition of lipogenesis and macrophage polarization” 的论文。该研究揭示了肝细胞中 Smad4 在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）发展中的关键作用，为 NAFLD 的防治提供了新的潜在靶点，在肝脏疾病研究领域具有重要意义。

一、研究背景

NAFLD 作为慢性肝脏疾病的主要病因，已成为严峻的公共卫生问题，全球近三分之一的成年人口受其影响。它是一种复杂的多因素疾病，由环境因素和遗传易感性共同作用，涵盖从单纯性肝脂肪变性到脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化，甚至肝细胞癌的一系列病理阶段。在 NAFLD 发展过程中，肝细胞内甘油三酯、游离脂肪酸（FFA）和胆固醇过度积累，引发胰岛素抵抗，导致甘油三酯合成和转运功能失调。过多的脂质积累会诱导脂毒性，损害线粒体功能，引发内质网应激和炎症反应，同时增强线粒体 β - 氧化，使肝脏对氧化应激更为敏感，加剧肝损伤。

肝脏巨噬细胞在调节肝细胞代谢和维持肝脏免疫耐受方面发挥核心作用。正常生理条件下，肝脏巨噬细胞倾向于 M2 表型，可通过分泌白细胞介素（IL）-4 和 IL-13 抑制炎症。然而，在 NAFLD 进展时，肝星状细胞激活、血液中脂多糖水平升高以及 FFA 激活炎症小体等变化，会刺激炎症发生，增加分泌促炎细胞因子的 M1 巨噬细胞比例。

转化生长因子 β（TGF-β）信号通路在细胞生长、凋亡、迁移和癌症发展等过程中起重要作用，Smad 是其下游信号分子。Smad4 作为 TGF-β 信号的核心介质，能与多种 Smad 蛋白结合，调节下游基因表达。已有研究表明，随着正常肝组织向 NAFLD 及非酒精性脂肪性肝炎（NASH）进展，肝细胞 Smad4 表达水平逐渐升高，Smad4 缺失可减轻 NASH 中的炎症、纤维化和肝细胞凋亡，但 Smad4 在肝细胞中影响 NAFLD 的具体分子机制仍不明确。

二、研究材料与方法

（一）实验动物

使用 C57BL/6 背景的 Smad4 flox/flox 和 AlbSmad4-/- 小鼠，通过 Alb-Cre 和 Smad4 flox/flox 小鼠杂交获得肝细胞特异性敲除 Smad4 的小鼠（AlbSmad4-/-），以 cre 阴性的同窝小鼠作为对照。所有小鼠饲养于特定病原体 - free、湿度和温度可控的微隔离笼中，保持 12 小时光照 / 黑暗循环。实验所用小鼠为 5 - 6 周龄。

（二）细胞系及处理

使用 AML12 和 RAW264.7 细胞系，AML12 细胞培养于添加多种成分的 DMEM/F12 培养基，RAW264.7 细胞培养于添加 10% 胎牛血清和 1% 青霉素 / 链霉素的 DMEM/1640 培养基，细胞培养条件为 37°C、5% CO?。实验中，AML12 细胞会暴露于棕榈酸（500 μM）24 小时，或用 P38 MAPK 抑制剂 SB203580（10 μM）、JNK 抑制剂 SP600125（10 μM）预处理 2 小时后，再用 50 ng/mL CXCL1 重组蛋白处理 24 小时。此外，AML12 和 RAW264.7 细胞还会用 50 ng/mL CXCL1 重组蛋白和 500 nM CXCL1 受体 CXCR2 抑制剂 SB225002 处理 24 小时。

（三）构建 NAFLD 模型

通过给小鼠持续喂食高脂肪饮食（HFD，60% 的总能量来自脂肪）16 周构建 NAFLD 模型，以喂食正常饮食（ND，10% 的总能量来自脂肪）的小鼠作为对照。

（四）检测方法

运用免疫组织化学、免疫荧光染色、Western blot 分析、实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）、酶联免疫吸附测定（ELISA）等技术，检测相关蛋白和基因的表达水平；通过油红 O 染色、苏木精 - 伊红染色观察肝脏脂肪积累情况；进行葡萄糖耐量试验评估小鼠的葡萄糖代谢能力。

三、研究技术路线

首先构建肝细胞特异性敲除 Smad4 的小鼠模型（AlbSmad4-/-），并建立 HFD 诱导的 NAFLD 小鼠模型。分别从体内和体外实验入手，在体内检测小鼠体重、血清和肝脏组织匀浆中的甘油三酯、游离脂肪酸等指标，对组织切片染色观察肝脏脂肪积累，用 RT-qPCR 检测脂肪生成、脂肪酸摄取和 β 氧化相关基因的表达。在体外，对 AML12 细胞进行 Smad4 敲低处理，用棕榈酸处理模拟 NAFLD 环境，检测 CXCL1 表达和分泌；利用抑制剂处理细胞，探究相关信号通路；使用重组蛋白和抑制剂处理细胞，研究 CXCL1 对脂肪酸合成和巨噬细胞极化的影响，从而全面探究 Smad4 在 NAFLD 中的作用及机制。

四、研究结果

（一）Smad4 在肝细胞中的表达在 NAFLD 进展过程中上调

研究人员通过组织芯片免疫组化评估 NASH 患者健康肝脏和 NASH 组织中 Smad4 的表达，发现 NASH 组织中 Smad4 表达显著高于健康对照组。分析公共基因表达数据库 GSE164760，也得到类似结果，即 NASH 组 Smad4 mRNA 水平明显高于健康对照组。在短期 HFD 小鼠 NAFLD 模型中，免疫组化染色显示脂肪肝组织肝细胞中 Smad4 表达显著上调，油红 O 染色显示 HFD 组有明显脂滴空泡，双重免疫荧光染色证实 Smad4 在大多数肝细胞中表达，Western blot 分析表明 HFD 处理小鼠脂肪肝组织中 Smad4 蛋白水平显著增加。这些结果表明，Smad4 在 NAFLD 期间在肝细胞中被激活，可能在 NAFLD 发病机制中起关键作用。

（二）肝细胞特异性缺失 Smad4 减轻高脂肪饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病

利用条件性 Smad4 敲除方法构建 AlbSmad4-/- 小鼠，通过双重免疫荧光染色和 Western blot 证实其原代肝细胞中 Smad4 缺失。建立 HFD 诱导的 NAFLD 模型后发现，与对照组相比，AlbSmad4-/- 小鼠在 HFD 喂养后体重和肝脏重量增加不明显，血清丙氨酸氨基转移酶、甘油三酯和非酯化脂肪酸水平更低，肝脏甘油三酯和非酯化脂肪酸水平显著降低，但血清天冬氨酸氨基转移酶和总胆固醇水平相似。葡萄糖耐量试验显示 AlbSmad4-/- 小鼠葡萄糖耐量受损。组织染色结果表明，AlbSmad4-/- 小鼠肝细胞中 Smad4 缺失减少了脂肪积累，而正常饮食喂养时两组小鼠无显著差异。这说明肝细胞特异性 Smad4 缺乏可减轻 HFD 诱导的 NAFLD 发展。

（三）肝细胞中 Smad4 缺失减轻肝脏炎症和 CXCL1 分泌

对 AlbSmad4-/- 和对照组小鼠肝脏组织进行免疫荧光染色，发现 HFD 喂养时，AlbSmad4-/- 小鼠中 F4/80 巨噬细胞和 CD11b 单核细胞的浸润减少，正常饮食时两组免疫细胞浸润相似。通过双重免疫荧光染色、RT-qPCR 和 ELISA 检测发现，AlbSmad4-/- 小鼠肝脏中 CXCL1 水平显著低于对照组。在体外实验中，用 siRNA 敲低 AML12 细胞中的 Smad4，并用棕榈酸处理后，RT-qPCR 和 ELISA 结果表明 Smad4 缺失减轻了棕榈酸诱导的 CXCL1 表达和分泌。这些结果表明，肝细胞特异性缺失 Smad4 可减轻肝脏炎症和 CXCL1 分泌。

（四）肝细胞 Smad4 通过 ASK1-P38-JNK 信号通路促进 CXCL1 分泌

研究发现，HFD 处理的 AlbSmad4-/- 小鼠肝脏组织中磷酸化 ASK1、P38 和 JNK 的表达低于对照组。在体外实验中，用 si-Smad4 和 sh-Smad4 敲低 AML12 细胞中的 Smad4 后，发现棕榈酸诱导的 ASK1 - P38 - JNK 通路激活受到显著抑制。使用 JNK 抑制剂和 p38 MAPK 抑制剂处理 AML12 细胞后，棕榈酸诱导的 CXCL1 分泌和 mRNA 表达均受到抑制。这表明 Smad4 在 NAFLD 进展过程中通过 ASK1 - P38 - JNK 信号通路促进 CXCL1 分泌。

（五）CXCL1 通过与 CXCR2 结合促进肝细胞脂肪酸合成

RT-qPCR 检测发现，Smad4 缺失显著抑制脂肪酸合成关键基因（ACC1、FASN 和 SCD1）和脂肪酸结合蛋白 1（FABP1）的表达，对脂肪酸摄取和 β 氧化相关基因表达影响不明显。分离原代肝细胞实验和细胞系实验进一步证实，Smad4 敲除减少了脂肪酸合成相关基因的表达和脂质沉积。研究还发现，CXCL1 可上调 AML12 细胞中 ACC1、FASN 和 SCD1 的表达，而 CXCR2 抑制剂可抑制这一作用。这说明 CXCL1 通过与 CXCR2 结合诱导肝细胞脂肪酸合成。

（六）CXCL1 促进巨噬细胞 M1 极化

研究发现，AlbSmad4-/- 小鼠肝脏中 M1 巨噬细胞数量比对照组显著减少，M2 样巨噬细胞数量相当。RT-qPCR 检测相关基因表达也得到类似结果。在体外实验中，用 LPS 和 IFN-γ 诱导 RAW264.7 细胞 M1 极化，发现 CXCL1 重组蛋白可进一步上调 M1 相关基因（CD86、iNOS、MCP1 和 TNF-α）的表达，而 CXCR2 抑制剂可消除这一作用；对于 M2 极化，CXCL1 和 CXCR2 抑制剂对相关基因（Arg1、IL-10 和 YM1）表达无显著影响。这表明 CXCL1 通过 CXCR2 促进巨噬细胞 M1 极化。

五、研究结论与讨论

该研究表明，肝细胞特异性 Smad4 表达通过增强 CXCL1 分泌促进 NAFLD 发展，靶向缺失肝细胞特异性 Smad4 信号可抑制 HFD 喂养小鼠的 NAFLD 进展。肝细胞特异性 Smad4 基因缺失抑制脂肪酸合成和巨噬细胞 M1 极化，肝细胞中的 Smad4 通过激活 ASK - P38 - JNK 信号通路加速 CXCL1 分泌，进而增强脂肪酸合成和巨噬细胞 M1 极化。

此前研究已指出 TGF-β/Smad 信号在代谢综合征和相关疾病中的重要性，但 Smad4 在 NAFLD 中的具体作用和分子机制尚不明确。本研究发现 Smad4 在 NAFLD 期间在肝细胞中被激活，且其激活不依赖于 TGF-β。同时，研究还发现 CXCL1 作为关键趋化因子，在 NAFLD 进展中发挥重要作用，其水平与 HFD 喂养时间和 PA 浓度相关，而肝细胞 Smad4 通过特定信号通路刺激 CXCL1 分泌，促进 NAFLD 发展。此外，研究首次证实肝细胞 Smad4 通过促进 CXCL1 分泌推动巨噬细胞向 M1 表型极化，而 CXCL1 对巨噬细胞 M2 极化无影响。

总体而言，该研究揭示了肝细胞中 Smad4 在 NAFLD 发展中的关键作用，Smad4 可能成为 NAFLD 潜在的预防和治疗靶点，为深入理解 NAFLD 发病机制和开发新的治疗策略提供了重要依据，有助于推动肝脏疾病防治领域的进一步研究和发展。