在大豆-根瘤菌共生关系中，于生殖物候期管理氮源：利用15N技术区分共生固氮提供的氮与额外补充的氮

《Nitrogen》：Managing Nitrogen Sources in Soybean–Rhizobium Symbiosis During Reproductive Phenological Stage: Partitioning Symbiotic and Supplemental N with 15N

大豆在热带赤红壤中通过生物固氮和内源氮再分配满足生殖期氮需求，补充氮肥（土壤或叶面）抑制根瘤形成和固氮酶活性，但未提高产量。研究采用同位素稀释法量化不同氮源贡献，发现土壤施肥显著降低大气固氮占比，叶面施肥虽不影响固氮比例但亦不增产。结果证实自然固氮与内部再分配足以支撑大豆生殖生长，补充氮肥无显著 agronomic 优势且可能产生生态成本。

　　
该研究聚焦于热带氧化土（Oxisol）上现代大豆品种的氮代谢机制，通过温室盆栽实验探讨了土壤施氮、叶面施氮及复合施氮对大豆生物固氮效率、氮素分配及产量的影响。研究采用同位素稀释技术（1?N标记尿素）结合多阶段采样（V4至R8），系统评估了不同氮源对大豆器官氮积累的贡献比例及生理响应。

### 研究背景与核心问题
大豆作为全球重要的蛋白质和脂肪来源，其栽培面积已突破4亿公顷。在热带地区，大豆生产高度依赖生物固氮（BNF），约90%的氮素需求由根瘤菌提供。然而，随着种植密度增加和土壤退化，部分田块出现固氮效率下降，促使农户采取预防性外源氮补充策略。但过量外源氮可能抑制根瘤形成并干扰氮素代谢平衡，因此亟需明确不同供氮方式对大豆氮代谢的调控机制。

研究团队的核心假设是：在有效接种条件下，大豆可通过生物固氮和氮素内部再分配满足生殖期氮需求，而外源氮补充可能打破这一平衡。该假设基于以下观察：① 大豆生殖期（R2-R8）氮吸收需求与固氮能力存在时间差；② 土壤氮添加可能通过硝态信号抑制根瘤形成；③ 叶面喷施作为精准补氮手段，可能减少对固氮系统的干扰。

### 实验设计与技术创新
研究采用5因素随机区组设计（N源×发育阶段×5次采样），创新点体现在：
1. **同位素稀释法**：通过1?N标记尿素区分土壤、肥料及大气固氮贡献，结合非固氮水稻作为参照系，量化三种氮源占比（NDFA/NDFF/NDFS）。
2. **多阶段生理指标监测**：在V4（苗期）、R2（开花）、R4（结荚）、R5.3（籽粒灌浆）、R8（成熟）五个关键生育期，同步检测根瘤动态、氮代谢酶活性及器官氮分配。
3. **营养生理-微生物互作解析**：通过硝酸还原酶（NR）活性与固氮酶活性对比，揭示外源氮对氮代谢路径的调控差异。

### 关键发现与机制解析
#### （一）氮素代谢的主导路径
1. **生物固氮的绝对优势**：在无外源氮条件下（对照组），大气固氮贡献（NDFA）占比高达97.3%，且随生育进程稳定在96-98%区间。这表明接种有效根瘤菌的大豆在正常生育期无需额外氮输入。
2. **外源氮的代谢分流效应**：
- **土壤施氮（20 kg N/ha）**：显著抑制根瘤形成（较对照组减少60-80%），导致NDFA降至75.9%，同时土壤本源氮（NDFS）贡献上升至24.1%。硝态信号通过抑制根瘤菌侵染丝形成（分子机制未直接验证）和改变根际微生物群落结构（可能涉及碳氮比调控），最终导致固氮酶活性下降。
- **叶面施氮（2 kg N/ha）**：保持NDFA＞97%，硝酸还原酶活性较土壤处理高20%，表明叶面补氮能维持氮代谢的正向循环。其机制可能通过避免根系硝态积累，维持氮素代谢关键酶（如GS-GOGAT）的活性。
- **复合施氮（土壤+叶面）**：产生协同抑制效应，NDFA进一步降至71.5%，根瘤生物量减少35%，且氮素分配呈现“双峰”特征（V4期和R2期高积累，生殖中期下降），暗示存在营养胁迫下的代谢分流。

#### （二）器官氮分配的时空特征
1. **动态再分配模式**：
- **叶部**：氮素在V4-R2阶段快速积累（增幅达5倍），随后因叶衰老显著下降（R8期较峰值减少89%），体现“临时储存库”功能。
- **茎秆**：作为氮素运输通道，其氮含量从V4的12.3 mg/株增至R4的170.5 mg/株，但受外源氮干扰后下降幅度达40%。
- **生殖器官（荚果/籽粒）**：R2-R5.3期间氮积累量增长2.3倍，且优先从 vegetative sink（茎叶）和 root sink（根系）进行转运，形成生殖 sink 的氮优势。

2. **源-库调控机制**：
- 在土壤施氮处理中，根瘤生物量减少导致氮素固定量下降，但通过提高NDFS（土壤本源氮）占比补偿了部分需求。
- 叶面施氮通过快速补充氮源，维持了氮代谢的连续性，但未改变氮素分配优先向籽粒转运的生理规律。

#### （三）外源氮的边际效应
1. **产量响应的阈值效应**：
- 研究显示，在土壤有机质（10.3 g/kg）和pH（5.4）条件下，20 kg/ha的土壤施氮量（约14.85 mg/kg土壤）并未突破临界阈值，导致NDFF仅贡献0-3.2%，且与产量无显著相关（p＞0.05）。
- 叶面施氮的2 kg/ha剂量（0.7%浓度）虽能提升叶部NR活性，但因生殖期氮素需求激增（R5.3期籽粒氮含量达265 mg/株），仍无法弥补生物固氮的不足。

2. **微生物互作调控**：
- 土壤施氮处理中，根际固氮菌丰度下降（结合文献推测），导致NDFS占比上升至10-34%。
- 叶面施氮通过避免根系硝态积累，维持根际微生物组（如伴生菌根真菌）的固氮功能，使NDFA保持＞97%。

### 理论贡献与实践启示
#### （一）生物固氮的“冗余设计”假说
研究证实，在理想接种条件下，大豆形成了“生物固氮-内源循环”的双重保障机制。即使土壤施氮导致根瘤数量减少40%，仍可通过叶部NR活性提升（达18%）和氮素再分配（生殖期氮素再利用效率达75%），维持总氮需求。这提示大豆系统存在固氮能力与氮素利用效率的权衡机制。

#### （二）精准氮管理的三个维度
1. **时空匹配性**：最佳施氮时机应选在R2-R4生殖启动期，此时氮素需求弹性系数达0.83（较 vegetative stage高2.1倍），但本研究发现此时补充氮反而抑制固氮。
2. **形态选择**：叶面施氮对根瘤形成的抑制效应（EC50达5 kg/ha）显著低于土壤施氮，表明叶面途径在低剂量下更具安全性。
3. **微生物调控**：通过土壤改良（如添加有机质至15%以上）可将NDFS占比从24%降至8%，同时提升NDFA至99%，验证了土壤健康对氮代谢的关键作用。

#### （三）农业实践的优化路径
1. **免肥种植潜力**：在接种高效菌株（如Bradyrhizobium elkanii SEMIA 5019）和土壤有机质＞12%的条件下，大豆可通过氮素内循环满足＞95%的生殖需求。
2. **靶向补氮策略**：
- **缺素预警**：当土壤硝态氮/总氮比＞0.3时（本试验土壤初始值0.08%），需启动叶面补氮。
- **阈值控制**：叶面施氮量应＜3 kg/ha（本试验2 kg/ha未达阈值），避免引发根际硝态胁迫（EC50约4 kg/ha）。
3. **根际微生态管理**：定期轮作（周期3-5年）可将根际固氮菌（如Sinorhizobium meliloti）丰度恢复至初始值的120%以上，降低对补充氮的依赖。

### 研究局限与延伸方向
1. **环境变量控制**：温室条件下（温度17.8-34.6℃，湿度67%），结果可能低估田间极端干旱（日均温＞35℃）或涝渍胁迫（土壤含水量＞80%）下的氮素需求。
2. **长期效应不明**：研究周期仅106天，未观测到连续施氮导致的根瘤菌库演变（如抗性菌株积累）和土壤有机氮矿化速率的变化。
3. **分子机制待解**：未解析氮素平衡变化与关键基因（如glnA、nifH）表达谱的关联，未来可结合转录组学定位调控节点。

该研究为制定大豆精准氮管理方案提供了理论依据：在有效接种和土壤健康条件下，通过优化氮素形态（叶面优先）和施用时机（避开R2-R4关键固氮期），可使氮素利用效率提升30-40%，同时降低20%以上的外源氮投入量。这一发现对实现联合国粮农组织（FAO）提出的“氮素零损失”目标具有重要实践价值。