盐碱胁迫下阴沟肠杆菌DJ株的趋化行为及其GABA介导的适应机制研究

《FEMS Microbiology Ecology》：Saline-alkaline mediated chemotaxis in the plant growth-promoting rhizobacterium Enterobacter cloacae

为解决盐碱地微生物定殖效率低下的问题，研究人员开展了关于阴沟肠杆菌DJ株在盐碱胁迫下趋化行为的研究。结果表明，Na+是驱动DJ株向盐碱环境趋化的关键因子，其通过激活谷氨酸脱羧酶(GAD)活性，促进γ-氨基丁酸(GABA)的合成与分泌，进而调控趋化相关基因tsr和Che-Y的表达，最终增强菌株的盐碱适应性。该研究为利用植物根际促生菌(PGPB)改良盐碱土壤提供了新的理论依据。

　　

土壤盐碱化是威胁全球粮食安全与土地资源可持续利用的重大挑战。面对这一严峻形势，利用植物根际促生菌(PGPB)来改良盐碱土壤、促进作物生长，已成为一种极具潜力的生物修复策略。然而，这些有益微生物能否在恶劣的盐碱环境中成功定殖，是其发挥功能的前提。其中，趋化行为——即细菌感知并主动趋向于有利环境的能力，是决定其定殖效率的关键第一步。那么，PGPB是如何感知并主动趋向于盐碱环境的？其背后又隐藏着怎样的分子调控机制？这些问题亟待解答。

为了揭开这一谜团，来自长春师范大学的研究团队将目光投向了从吉林西部盐碱地羊草根际分离出的阴沟肠杆菌DJ株。该菌株不仅具有固氮、解磷、解钾等促生特性，还表现出对盐碱胁迫的强适应性。研究人员发现，在盐碱胁迫下，DJ株会大量合成并分泌一种名为γ-氨基丁酸(GABA)的小分子物质。GABA在植物抗逆中扮演着重要角色，但在细菌适应盐碱环境中的作用尚不明确。因此，该研究旨在深入探究GABA在DJ株盐碱趋化行为中的具体作用机制，为开发高效的盐碱地生物改良菌剂提供理论支撑。相关研究成果已发表于《FEMS Microbiology Ecology》。

关键实验方法

本研究主要采用了液体培养与半固体琼脂平板法，系统评估了阴沟肠杆菌DJ株在不同条件下的生长、pH变化及趋化行为。通过ELISA试剂盒检测了培养上清液中GABA的浓度，利用酶活试剂盒测定了谷氨酸脱羧酶(GAD)的活性，并采用qPCR技术分析了趋化相关基因tsr和Che-Y的表达水平。

研究结果

1. 不同培养条件对DJ株生长状态的影响

研究人员首先监测了DJ株在不同培养条件下的生长曲线。结果显示，无论是对照组还是盐、碱、盐碱混合的实验组，DJ株在24小时的培养过程中均表现出相似的生长趋势，最终OD₆₀₀值均达到1.0左右。这表明DJ株对盐碱环境具有天然的适应能力，能够在胁迫条件下维持正常的生长。

2. DJ株在不同培养条件下的运动性与趋化行为

为了进一步探究DJ株的适应能力，研究人员利用半固体琼脂平板法评估了其运动性。结果发现，在盐碱混合条件下，DJ株的菌落直径最大，达到3.9±0.3 cm，显著高于对照组的1.7±0.2 cm。为了确认这种运动性是否与趋化行为相关，研究人员设计了专门的趋化验证实验。他们将半固体平板分为两半，一半为盐碱环境，另一半为对照环境。结果显示，DJ株在盐碱区域的迁移半径显著大于对照区域，证明其确实对盐碱环境表现出强烈的正趋化性。

3. Na⁺浓度对DJ株趋化行为的影响

由于所有实验组均含有Na⁺，研究人员推测Na⁺可能是影响DJ株趋化行为的关键因素。为了验证这一假设，他们用KOH替代NaOH来调节培养基的pH值。结果发现，当pH用KOH调节时，碱性环境下的菌落直径与对照组无显著差异；而添加NaCl的实验组则表现出明显的菌落直径增加。这表明DJ株的趋化行为是Na⁺依赖性的。进一步的NaCl浓度梯度实验表明，在Na⁺浓度达到90 mmol/L之前，DJ株的趋化反应随着Na⁺浓度的升高而增强，但当浓度达到90 mmol/L时，细菌生长受到抑制。

4. DJ株培养上清液pH、GABA浓度及趋化相关基因表达的变化

研究人员检测了培养过程中上清液pH和GABA浓度的变化。结果显示，在培养4小时后，所有组的pH值均出现下降，其中盐碱组和碱组的下降幅度更为明显。与此同时，GABA的浓度在培养8-16小时期间逐渐升高，在12小时时，盐碱组和盐组的GABA浓度分别达到13±0.38 μmol/L和10.5±1.12 μmol/L。qPCR分析表明，在盐碱胁迫下，DJ株中与感知环境pH变化相关的tsr基因和与细菌运动性相关的Che-Y基因的表达水平在12-16小时期间显著上调。

5. DJ株中GAD酶活性的测定

GAD是GABA合成的关键酶。研究人员测定了DJ株在不同培养条件下的GAD活性。结果显示，在培养4小时后，GAD活性达到峰值，其中盐碱组的酶活性最高，为2.44±0.14 U/mg，显著高于对照组。此后，GAD活性逐渐下降，但在盐碱组中，其活性在10小时前仍显著高于对照组，之后几乎检测不到。

结论与讨论

本研究系统揭示了阴沟肠杆菌DJ株在盐碱胁迫下的趋化适应机制。研究结论表明，DJ株在盐碱环境中表现出最强的运动性和正趋化性，且这一行为是Na⁺依赖性的。Na⁺通过激活GAD酶活性，促进了GABA的合成。GABA在DJ株的适应过程中扮演了双重角色：一方面，胞内合成的GABA进入三羧酸循环，为细菌的运动提供能量；另一方面，分泌到胞外的GABA逐渐积累，改变了菌株的微环境，并可能通过重新进入细胞，影响菌株的生长、发育及其盐碱适应性。同时，盐碱胁迫还上调了趋化相关基因tsr和Che-Y的表达，进一步增强了菌株的趋化能力。

该研究的重要意义在于，首次将GABA的合成与细菌的趋化行为联系起来，提出了一个“Na⁺激活GAD酶→合成GABA→调控趋化基因表达→增强盐碱适应性”的分子调控模型。这一发现不仅深化了我们对植物根际促生菌适应盐碱环境的分子机制的理解，也为利用GABA途径选育和改造高效盐碱地改良菌株提供了新的靶点和理论依据，对于推动盐碱地生物修复技术的应用具有重要的指导价值。