《Sensors and Actuators B: Chemical》：Facile environmental DNA metabarcoding enabled by dissolvable hydrogel bead-templated emulsification
编辑推荐：
数字PCR、水凝胶微球、环境DNA、代谢组学、DTT还原剂
Fuyang Qu|Rongjie Zhao|Juan Li|Yifang Chen|Luoquan Li|Meng Yan|Yi-Ping Ho
中国香港特别行政区香港中文大学工程学院生物医学工程系
摘要
基于液滴的数字聚合酶链反应（ddPCR）被广泛用于扩增环境DNA（eDNA），以实现单物种鉴定和基于宏条形码的整个群落评估。最近开发的氢凝胶珠模板乳化技术大大简化了水包油（W/O）液滴的生成过程。我们之前已经证明，珠模板液滴数字PCR（bdPCR）能够识别一个目标物种，然而，珠子中的氢凝胶网络仍然阻碍了扩增子在液滴反应器中的扩散，从而限制了PCR产物的产量，尤其是在反应达到平台期时。此外，bdPCR作为eDNA宏条形码分析替代方法的可行性尚未得到探索。在这项研究中，我们通过将可溶解的聚丙烯酰胺（PAA）氢凝胶珠纳入系统来生产液滴，实现了eDNA的bdPCR并随后进行扩增子测序以进行宏条形码分析。我们发现，添加还原剂（具体来说是0.1 mM的二硫苏糖醇（DTT）可以充分破坏PAA网络，促进扩增子在珠模板液滴内的自由扩散。测序结果显示，与ddPCR相比，基于bdPCR的扩增子能够识别出更多的鱼类物种。总之，这种基于bdPCR的工作流程结合了珠模板乳化法简便的液滴生成能力和与ddPCR相当的性能，适用于eDNA的宏条形码分析。因此，这项研究为eDNA宏条形码分析提供了一种简便可靠的方法，特别是对于稀有和濒危物种的研究，有望推动海洋物种研究和海洋生物多样性的评估。
章节摘录
引言
环境DNA（eDNA）作为一种强大的分子工具，由于其成本效益高、灵敏度高和非侵入性采样的特点，彻底改变了水生和陆地生态系统的生物多样性调查[1]，[2]。结合核酸扩增技术，可以从eDNA样本中识别出濒危物种、稀有物种或其他感兴趣的物种[2]。此外，eDNA还有助于分类鉴定和物种数量估计
微流控芯片的制备
微流控芯片是通过软光刻技术制备的[28]，[29]。如图S1所示的设计芯片图案使用AutoCAD软件（Autodesk，美国）绘制，并在分辨率为25,000 DPI的光掩模上印刷（MicroCAD Photo-Mask Ltd.，中国）。通过适当的曝光剂量，这些图案被转移到涂有SU8 3050光刻胶的4英寸硅片上（Kayaku Advanced Materials，美国）。经过烘烤和显影后，未交联的部分被清除
结果与讨论
首先评估了多孔PAA氢凝胶网络的渗透性，以确认PCR成分（尤其是PCR聚合酶）能够渗透该网络。在聚合过程中，将丙烯酸改性的DNA模板整合到可溶解的PAA氢凝胶网络中。另一项实验验证了0.1 mM的DTT可以在两分钟内完全溶解由6%（w/v）丙烯酰胺单体和0.2%（w/v）BAC交联剂制成的PAA珠（图S3）。此前的研究
结论
总之，本研究提出了一种用于常规eDNA分析的基于bdPCR的工作流程，该流程采用了可溶解的PAA氢凝胶珠模板乳化技术。优化的PAA珠组成确保了PCR混合物（包括聚合酶）在珠模板乳化之前有效渗透到氢凝胶网络中。在乳化过程中加入浓度为0.1 mM的还原剂DTT，可以破坏PAA网络，从而进一步促进扩增子的扩散
CRediT作者贡献声明
Yifang Chen：撰写 – 审稿与编辑、方法学研究、实验设计。Juan Li：撰写 – 审稿与编辑、数据可视化、结果验证、实验设计、数据分析、概念构建。Rongjie Zhao：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、结果验证、方法学研究、数据分析、概念构建。Fuyang Qu：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、结果验证、方法学研究、数据分析、数据管理、概念构建。Ho
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了中国香港特别行政区海洋保护增强基金（MCEF20108_L02）、香港特别行政区研究资助委员会（项目编号：CUHK 14219922、14207424和C5005-23WF）以及国家重点实验室海洋污染研究项目的种子合作研究基金计划（SKLMP/SCRF/0042）的支持，后者定期获得香港特别行政区创新与技术委员会（ITC）的科研资助。然而，任何观点和发现均不代表相关机构的官方立场
Fuyang Qu目前是香港中文大学生物医学工程系的博士后研究员。他的研究兴趣在于开发用于肿瘤球体培养和单细胞分析的液滴微流控技术。
