柿梅奇酵母新型硫氧还蛋白MpTRX1的鉴定及其在氧化应激耐受中的功能解析

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Identification and functional characterization of a novel thioredoxin MpTRX1 from Metschnikowia persimmonesis

本研究针对柿梅奇酵母(Metschnikowia persimmonesis)中氧化应激响应机制未知的问题，开展了新型硫氧还蛋白MpTRX1的功能表征研究。通过异源表达和生化分析，证实MpTRX1具有典型的二硫键还原酶活性，其CXXC活性位点对功能至关重要。在酿酒酵母中过表达MpTRX1可显著增强对H2O2诱导氧化应激的耐受性，为开发基于酵母的生物防治剂提供了分子基础。

　　

在植物表面栖息着一类特殊的微生物居民——附生酵母，它们与植物宿主形成互利共生关系，不仅能促进植物生长，还能增强植物对环境胁迫的抵抗力。其中，梅奇酵母属(Metschnikowia)的物种因其分布广泛且具有显著的抗菌活性而备受关注。最近从柿子(Diospyros kaki)花萼中分离鉴定的柿梅奇酵母(Metschnikowia persimmonesis)更显示出对多种植物病原菌的强大拮抗能力，展现出作为农业生物防治剂的巨大潜力。

然而，尽管柿梅奇酵母的应用前景广阔，科学家们对其分子机制却知之甚少。特别是在氧化应激响应方面，这种酵母如何维持细胞内氧化还原平衡仍是一个未解之谜。氧化应激是生物体面临的重要挑战之一，活性氧(ROS)如过氧化氢(H₂O₂)会破坏蛋白质、脂质和DNA等生物大分子，导致细胞功能受损。在所有生物体中，硫氧还蛋白(Thioredoxin, TRX)作为一类小型、保守的氧化还原活性蛋白，在维持细胞氧化还原稳态中扮演着核心角色。

硫氧还蛋白通过其保守的CXXC活性位点（通常是CGPC motif）催化底物蛋白中二硫键的还原，参与DNA合成、抗氧化防御和信号转导等多种细胞过程。在模式生物如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，两个胞质硫氧还蛋白(Trx1和Trx2)已被证明能够保护细胞免受氧化损伤并调节关键代谢过程。但是，柿梅奇酵母中的硫氧还蛋白却从未被鉴定或功能表征。

正是基于这一研究空白，来自庆尚国立大学和韩国韩医学研究院的研究团队在《Applied Microbiology and Biotechnology》上发表了他们的最新研究成果。他们首次从柿梅奇酵母中鉴定并功能表征了一个新型硫氧还蛋白MpTRX1，为理解这种具有应用潜力的酵母的氧化应激响应机制提供了重要见解。

研究人员采用了多种关键技术方法开展本研究：通过生物信息学分析从柿梅奇酵母基因组中鉴定候选硫氧还蛋白基因；利用基因克隆和位点定向突变技术获得野生型和突变型MpTRX1；通过蛋白质异源表达和纯化技术制备重组蛋白；采用DTNB和胰岛素还原分析法测定酶活性；通过酵母点斑实验、存活率分析和台盼蓝染色评估氧化应激耐受性。实验所用柿梅奇酵母菌株由研究团队自行分离鉴定。

探索和克隆MpTRX1作为柿梅奇酵母中的新型TRX基因

研究团队首先通过生物信息学方法在柿梅奇酵母基因组中搜寻硫氧还蛋白同源基因。使用TBLASTN工具，以Pfam数据库中硫氧还蛋白结构域(PF00085)为查询序列，在柿梅奇酵母全基因组中鉴定出8个具有显著比对得分的序列。其中，基因HF325_004745显示出最高的比对得分(120 bits)，因此被选为研究对象，命名为MpTRX1。

该基因位于基因组Contig 6的反向链上，包含312个碱基对，编码一个由103个氨基酸组成的蛋白质。研究人员成功通过PCR扩增了包含完整编码序列的基因组片段，并进行了克隆，为后续功能研究奠定了基础。

MpTRX1作为TRX蛋白的序列分析

序列分析显示，MpTRX1与酿酒酵母ScTRX1具有62%的氨基酸序列同一性和77%的相似性。此外，它与多种生物的硫氧还蛋白也显示出显著的序列相似性，包括人类TXN(46.5%)、大肠杆菌TrxA(45%)、小鼠Txn1(44.8%)、拟南芥AtTRX h1(44.3%)和莱茵衣藻CmCTRX1(41.4%)。

为了获得结构层面的认识，研究团队使用AlphaFold2预测了MpTRX1的三维结构。预测模型显示出典型的硫氧还蛋白折叠特征：由四个α螺旋和五个β折叠构成，并包含位于30-33位氨基酸的保守 redox-active CXXC motif(CGPC)。这一结构特征进一步支持MpTRX1属于功能性硫氧还蛋白家族。

MpTRX1的结构特征

MpTRX1活性位点包含两个保守的半胱氨酸残基，这些残基被认为对其还原酶活性至关重要。为了实验验证这一点，研究人员通过位点定向突变技术构建了单个或双半胱氨酸突变为丝氨酸的突变体：MpTRX1M1、MpTRX1M2和MpTRX1M3。

蛋白质电泳分析发现，在非还原条件下，野生型MpTRX1和MpTRX1M2（仅第二个半胱氨酸突变）形成了二聚体和多聚体，而MpTRX1M1（仅第一个半胱氨酸突变）和MpTRX1M3（双突变）则主要呈现单体形式。这一结果表明，活性位点半胱氨酸不仅参与电子传递，还介导分子间二硫键的形成，这是硫氧还蛋白介导氧化还原调节的典型特征。

MpTRX1还原酶活性的确认

为了验证MpTRX1的还原酶活性，研究人员使用了两种底物：化学底物DTNB和蛋白质底物胰岛素。DTNB还原实验显示，MpTRX1的活性呈浓度依赖性增加，但5μM MpTRX1的活性低于同等浓度的大肠杆菌TrxA，仅为其活性的76.8%。胰岛素还原实验同样显示，MpTRX1能够以浓度依赖的方式还原胰岛素中的二硫键。

重要的是，活性位点半胱氨酸突变体在两种测定中都显示几乎无活性。双突变体MpTRX1M3的活性与无硫氧还蛋白的对照组相当，而单突变体MpTRX1M1和MpTRX1M2也只显示微弱活性。这些结果明确证实，两个半胱氨酸残基对MpTRX1的还原功能都是不可或缺的。

MpTRX1在酵母细胞氧化应激响应中的作用

由于柿梅奇酵母的遗传操作工具尚不完善，研究人员选择在酿酒酵母中异源表达MpTRX1，以研究其在氧化应激响应中的潜在功能。他们将MpTRX1和催化失活突变体MpTRX1M3的编码序列克隆到酵母表达载体pYES2中，并在GAL1启动子控制下在酿酒酵母W303菌株中表达。

点斑实验显示，在含11 mM H₂O₂的平板上，表达MpTRX1的酵母菌株生长明显优于空载体对照和MpTRX1M3表达菌株。存活率分析进一步证实，在50 mM H₂O₂处理1小时后，MpTRX1表达细胞的存活率(44±4.59%)显著高于对照组(低于30%)，提高了约76%。台盼蓝排除实验也支持这一结果，表明MpTRX1表达能有效保护酵母细胞免受氧化损伤。

研究结论与意义

本研究首次从柿梅奇酵母中鉴定并功能表征了一个新型硫氧还蛋白MpTRX1。通过生物信息学、生物化学和遗传学方法的综合运用，研究人员证实MpTRX1具有典型的硫氧还蛋白序列和结构特征，包含保守的CXXC活性 motif和TRX折叠结构。

体外酶活实验证明，重组MpTRX1能够以浓度依赖的方式还原DTNB和胰岛素中的二硫键，而活性位点半胱氨酸的突变完全消除了这一活性。在酿酒酵母中的异源表达实验进一步显示，MpTRX1能够显著增强酵母细胞对过氧化氢诱导的氧化应激的耐受性，而催化失活突变体则无此保护作用。

这些发现不仅首次揭示了柿梅奇酵母中氧化应激响应的分子机制，也为开发基于该酵母的生物防治策略提供了理论依据。研究人员推测，通过增强柿梅奇酵母的氧化应激耐受性，MpTRX1可能有助于该酵母在植物表面的稳定定殖，从而更有效地发挥其生物防治功能。尽管本研究是在异源系统中进行的，但它为后续在柿梅奇酵母自身中研究MpTRX1的生理功能奠定了基础，并开辟了利用酵母氧化还原系统改善作物保护的新途径。

这项研究的意义不仅在于首次分子水平表征了柿梅奇酵母的蛋白质，更在于为理解附生酵母与宿主植物的互作机制提供了新视角。未来研究可进一步探索MpTRX1在柿梅奇酵母与柿子共生关系中的具体作用，以及如何利用这一氧化还原系统开发更有效的农业生物防治策略。随着对微生物-植物相互作用机制的深入理解，基于酵母的生态友好型农业解决方案有望为可持续农业发展做出重要贡献。