非培养策略发现新型耐热脂肪酶及其产酶菌株：揭示中温厌氧消化污泥中脂质降解的关键角色

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Culture-independent discovery of a novel thermotolerant lipase and its producer from mesophilic anaerobic digestion sludge

为解决厌氧消化中脂质水解关键微生物及其功能酶鉴定困难的问题，研究人员开展了一项整合酶谱、宏蛋白质组学和宏基因组学的功能筛选研究。该研究成功从中温厌氧消化污泥中鉴定出一种新型耐热脂肪酶（hp2-1）及其产酶菌株，该酶具有极端嗜热（最适温度97.5°C）和嗜碱（最适pH 11）特性，其产酶菌株被鉴定为与Candidatus Scatomorpha密切相关的新属。这一发现不仅揭示了厌氧消化系统中脂质降解的关键微生物，也为工业生物技术提供了极具应用潜力的新型酶资源。

　　

在追求绿色能源的浪潮中，厌氧消化技术因其能将有机废弃物转化为生物甲烷而备受关注。其中，富含能量的脂质（如油脂）是极具潜力的底物，其理论产甲烷量远高于碳水化合物和蛋白质。然而，一个关键瓶颈限制了这一潜力的发挥：脂质降解的第一步——水解，往往成为整个过程的限速步骤。尽管科学家们知道，这一步骤由分泌脂肪酶的微生物完成，但长期以来，这些在厌氧环境中“默默耕耘”的关键微生物及其功能酶的身份，却如同一个“黑箱”，难以被准确识别。传统的基于序列同源性的方法常常“失灵”，因为许多具有脂解活性的蛋白质与已知的脂肪酶序列相似性极低，导致它们被错误地归类为“假想蛋白”而被忽略。因此，开发新的策略来直接“捕捉”环境样本中具有活性的酶及其生产者，对于理解厌氧消化生态系统的运作机制、优化工艺参数至关重要。

为了回答这些问题，来自日本东北大学的研究团队Riku Sakurai、Yasuhiro Fukuda和Chika Tada在《Applied Microbiology and Biotechnology》上发表了一项研究。他们采用了一种创新的“功能宏蛋白质组学”策略，将酶谱法、宏蛋白质组学和宏基因组学技术相结合，直接从中温厌氧消化污泥中鉴定出具有活性的脂解酶及其编码微生物。该研究不仅发现了一种具有极端嗜热和嗜碱特性的新型脂肪酶，还重建了其产酶菌株的基因组，揭示了其在脂质降解中的关键生态角色。

关键实验方法

研究人员从处理富脂食物废物的中温厌氧消化厂采集污泥样本。首先，通过二维凝胶电泳结合酶谱法（Zymography）对污泥总蛋白进行分离和活性筛选，直接定位具有脂解活性的蛋白斑点。随后，利用质谱分析鉴定这些活性斑点中的蛋白质，并构建宏基因组数据库进行比对。通过宏基因组组装基因组（MAG）技术，重建了编码目标酶的微生物基因组，并对其进行了系统发育分析和代谢通路重建。最后，通过异源表达和纯化，对鉴定出的新型脂肪酶进行了详细的酶学性质表征，包括底物特异性、最适温度、最适pH和热稳定性等。

研究结果

1. 厌氧消化污泥中脂解蛋白的鉴定

研究人员首先利用二维凝胶电泳结合酶谱法对污泥样本进行分析。结果显示，在二维凝胶上共检测到四个具有脂解活性的蛋白斑点。质谱分析鉴定出多个蛋白质，其中大部分被注释为“假想蛋白”。通过异源表达实验，研究人员证实了其中一个假想蛋白（hp2-1）确实具有脂解活性，从而确认了其作为新型脂肪酶的身份。

2. hp2-1的表征

对hp2-1的深入分析揭示了其独特的性质。系统发育分析表明，hp2-1无法被归类到任何已知的35个脂肪酶家族或11个亚家族中，而是被预测为ABC转运蛋白底物结合蛋白（SBP），这暗示了其独特的进化起源。尽管序列上与传统脂肪酶差异巨大，但其催化机制与已知脂肪酶相似，其活性可被脂肪酶抑制剂PMSF所抑制。酶学性质分析显示，hp2-1具有广泛的底物特异性，对C4-C18的酯类均有活性，且对甘油二酯和甘油单酯的活性高于甘油三酯。最令人惊讶的是，尽管该酶来源于中温环境，却表现出极端嗜热和嗜碱的特性，其最适温度高达97.5°C，最适pH为11，且在30-99°C的宽温度范围内均表现出良好的热稳定性。

3. hp2-1编码微生物的基因组重建

研究人员成功重建了编码hp2-1的微生物基因组（SemiBin_309）。系统发育分析将其归类为Candidatus Scatomorpha属。然而，保守蛋白百分比（POCP）分析表明，该菌株与Candidatus Scatomorpha属的其他成员存在显著差异，可能代表了一个新的属。代谢通路重建显示，该菌株除了编码hp2-1外，还编码了另外5个潜在的脂肪酶。尽管未检测到脂肪酸降解相关基因，但该菌株拥有完整的甘油代谢通路，能够将脂质水解产生的甘油转化为乳酸和乙醇，并利用Rnf复合物和ATP合酶产生能量。此外，基因组中还鉴定出了Sec/SPII型分泌系统的关键组分，支持了hp2-1作为分泌蛋白的预测。

4. 新型脂解菌的栖息地分析

为了解该新型脂解菌的生态分布，研究人员利用公共数据库进行了栖息地分析。结果显示，该菌株的16S rRNA序列几乎只存在于沼气发酵罐中，在利用甜菜青贮、玉米青贮、乳清和食物废物等富脂底物的厌氧消化器中丰度较高，最高可达18.6%。这表明该菌株是厌氧消化系统，特别是处理富脂废物的系统中的关键功能微生物。

结论与讨论

本研究通过整合酶谱法、宏蛋白质组学和宏基因组学，成功实现了从环境样本中直接鉴定功能酶及其生产者的目标。研究不仅发现了一种具有极端嗜热和嗜碱特性的新型脂肪酶hp2-1，还揭示了其产酶菌株在厌氧消化系统脂质降解中的关键作用。该菌株能够分泌多种脂肪酶水解胞外脂质，并利用水解产物甘油进行发酵，产生乳酸和乙醇，从而在维持系统能量和氧化还原平衡中扮演重要角色。

这一发现具有多重重要意义。首先，它证实了在厌氧生态系统中，许多具有重要功能的酶可能因序列与已知酶差异巨大而被忽视，而功能导向的筛选策略是挖掘这些“暗物质”的有效手段。其次，hp2-1独特的酶学性质（最适温度97.5°C，最适pH 11）使其在工业生物技术领域具有巨大的应用潜力，特别是在需要高温或极端pH条件的生物催化过程中。最后，该研究为理解厌氧消化系统中脂质降解的微生物生态学提供了新的视角，为优化富脂废物处理工艺、提高生物甲烷产量奠定了理论基础。