巴斯德毕赤酵母中基于梯度甲醇补料策略的高效胶原蛋白模拟物生产优化研究

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Methanol feeding strategies for high-yield production of a collagen-based protein in Komagataella phaffii

本研究针对重组胶原类蛋白在Komagataella phaffii（K. phaffii）表达系统中产量低的技术瓶颈，系统比较了不同甲醇补料策略对胶原模拟蛋白（ColMP-His）生产的影响。研究发现甲醇限制性补料策略相比指数补料策略能显著提高蛋白表达效率，而梯度补料策略可实现83.9 g L-1的最高产量，为动物源胶原替代材料的规模化生产提供了工艺基础。

　　

在组织工程和再生医学领域，胶原蛋白作为细胞外基质的主要成分，一直是构建生物材料的核心原料。然而，传统动物源胶原存在批次差异大、病原体残留风险以及免疫原性问题，严重制约其临床应用。重组胶原技术的出现为解决这些问题带来了希望，但如何实现高产率生产仍是制约其产业化应用的关键瓶颈。

近年来，Komagataella phaffii（原名巴斯德毕赤酵母）因其兼具真核蛋白修饰能力和高密度发酵特性，成为重组胶原生产的理想表达系统。该酵母特有的AOX1（醇氧化酶1）启动子可实现严格甲醇诱导表达，但甲醇补料策略的优化对平衡细胞生长与蛋白表达至关重要。德国汉诺威莱布尼茨大学技术化学研究所的Ebbecke等人发表在《Applied Microbiology and Biotechnology》的研究，系统比较了不同甲醇补料策略对胶原模拟蛋白（ColMP-His）生产的影响，为规模化生产提供了重要工艺参数。

本研究采用的关键技术方法包括：在2L生物反应器系统中进行高密度发酵，通过在线甲醇传感器实时监测浓度；比较两阶段（甘油批式+甲醇诱导）和三阶段（甘油批式+甘油补料+甲醇诱导）发酵策略；采用His-Tag ELISA（酶联免疫吸附测定）对分泌表达的ColMP-His进行定量分析；通过湿细胞重量（WCW）监测生物量变化。

3.1 指数与限制性甲醇补料策略的影响

研究发现限制性补料策略虽然细胞生长较慢，但蛋白表达效率更高。在78小时诱导期内，湿细胞重量从100 g L^-1增至340 g L^-1，ColMP-His浓度达到51.3 g L^-1，而指数补料策略仅获得7.5 g L^-1的产量。特异性蛋白表达率分析显示，限制性策略的最高值（4.8 ng g^-1h^-1WCW）是指数策略（2.6 ng g^-1h^-1）的1.8倍。

3.2 三阶段发酵策略的影响

添加甘油补料阶段虽将初始生物量提高至200 g L^-1WCW，但最终蛋白产量反而降低至22.6 g L^-1，仅为两阶段策略的43%。这表明高初始细胞密度可能导致代谢负担增加和蛋白酶积累，不利于重组蛋白的稳定表达。

3.3 甲醇补料速率优化的影响

梯度补料策略（每12小时增加1 mL h^-1L^-1）表现出最佳性能，生物量持续增长至500 g L^-1WCW，ColMP-His浓度在120小时达到83.9 g L^-1，且未出现其他策略中观察到的平台期或下降现象。相比之下，固定补料速率（7.3-14.5 mL h^-1L^-1）均在70小时后出现蛋白降解。

研究结论表明，梯度甲醇补料策略通过动态调整碳源供给，有效平衡了细胞生长与蛋白表达的关系，避免了代谢负担和氧限制问题。该策略使ColMP-His产量较初始工艺提高11倍，且发酵过程耗氧量降低25%，显著提升了工艺经济性。值得注意的是，研究中采用的ELISA定量方法可能高估绝对蛋白浓度，但不同策略间的相对比较仍具有指导意义。

这项工作为动物源胶原替代材料的规模化生产提供了可靠工艺方案，特别是为光交联生物墨水的大规模应用奠定了基础。未来研究需着重解决批次间差异、开发在线监测技术，并建立更精确的蛋白定量方法，以推动重组胶原在生物制造领域的实际应用。