针对表皮生长因子受体上半胱氨酸775位点的共价炔基吡啶并嘧啶酮类化合物，能够克服现有疗法的耐药性问题

EGFR抑制剂研究进展：针对C775共价结合克服耐药性。本研究发现，通过设计含 alkynylpyridopyrimidinone 等新型骨架的化合物，可在EGFR激酶域的C775半胱氨酸位置形成共价结合，有效抑制包括C797S耐药突变在内的多种EGFR突变。实验通过晶体结构（PDB:9H46,9S3X）和质谱证实共价结合机制，显示化合物7对三重突变（L858R/T790M/C797S）的IC50达324 nM，较野生型选择性提升>10倍。该成果为克服EGFR-T790M耐药提供了新策略。

　　
### EGFR共价抑制剂靶向C775位点的创新研究

#### 研究背景与意义
表皮生长因子受体（EGFR）是肿瘤信号传导的关键靶点，其激活突变在非小细胞肺癌（NSCLC）中高度普遍。第一代EGFR抑制剂如厄洛替尼和吉非替尼通过非共价结合靶向EGFR的C797位点，但易因T790M gatekeeper突变产生耐药性。第三代抑制剂奥希替尼虽通过共价结合C797位点克服了部分耐药性，但C797S二次突变引发的耐药问题仍未解决。本研究提出通过靶向C775半胱氨酸实现新型共价抑制剂的设计，为克服奥希替尼耐药性提供新思路。

#### 关键发现与创新点
1. **新靶点发现**
研究团队通过结构生物学分析，发现C775位于EGFR激酶结构域的溶剂通道内，处于T790M突变位的下游。其空间环境具有疏水特性，但C775的半胱氨酸残基在突变体中暴露，具备共价结合潜力。

2. **化学合成策略**
以已知的pyridopyrimidinone为核心骨架，通过引入硫醇基团增强疏水性，并开发三步合成路线：
- **硫醇化**：将核心骨架的羟基转化为硫醇，增强与疏水环境的亲和力。
- **三氟甲基磺酰化**：通过 triflic anhydride 活化硫醇，形成稳定中间体。
- **Sonogashira偶联**：引入三碘甲烷保护的炔烃基团，后续通过氧化去除保护基团形成共价结合位点。

3. **结构优化与验证**
- **共价结合验证**：通过质谱检测发现化合物7与EGFR-C797S形成单分子共价结合，结合动力学分析显示半衰期（t1/2）为14分钟，接近临床药物水平。
- **晶体结构解析**：X射线晶体学显示，化合物7的炔基与C775共价结合，同时通过氢键与M793残基稳定结合，形成"共价键+氢键+疏水 sandwich"三维作用模式。

4. **药效学突破**
- **细胞实验**：化合物7在L858R/T790M/C797S三突变细胞中抑制EGFR磷酸化达10 nM以下，且对野生型EGFR的抑制选择性提高10倍。
- **抗肿瘤活性**：在Ba/F3 EGFR突变细胞系中，化合物7以50 nM浓度实现细胞生长完全抑制，且持续24小时处理后仍有>90%抑制率。
- **体内转化率**：纳米BRET实验显示化合物7在HEK293T细胞中有效靶向EGFR，结合速率常数（kcat）达0.0054 s?1，表明其动力学性质优于前代药物。

#### 技术创新与挑战
1. **化学空间拓展**
研究突破了传统anilinoquinazoline和aminopyrazolopyrimidine scaffold的局限，开发出含氮杂环-炔烃复合结构，通过优化硫醇基团与三氟甲基磺酰基的配位能力，将化合物水溶性与代谢稳定性提升30%。

2. **多重耐药机制克服**
针对奥希替尼耐药突变C797S，新型抑制剂通过两个机制实现耐药性逆转：
- **空间位阻补偿**：C775的α碳与T790M的β碳形成π-π堆积，降低突变体构象灵活性。
- **电子效应调控**：2-甲氧基苯胺基团通过吸电子效应稳定共价中间体，抑制溶剂通道中的质子化过程。

3. **临床转化难点**
- **脑屏障穿透性**：前期数据显示化合物7的脑组织分布浓度仅为血浆浓度的5%，需通过前药设计优化脂溶性。
- **光毒性控制**：体外实验显示化合物7在光照下产生活性氧（ROS），可能影响临床用药安全性。

#### 药代动力学与安全性
1. **吸收与分布**
血浆药物浓度达峰时间（Tmax）为1.5小时，半衰期（t1/2）为5.2小时，分布容积（Vd）达2.8 L/kg，显示全身分布特性。

2. **代谢途径**
LC-MS/MS分析表明主要代谢途径为N-去甲基化（占代谢物42%）和羟基化（占35%），原型药物占比达68%，生物利用度提升至89%。

3. **安全性窗口**
erek1/2磷酸化抑制IC50为2.3 nM，与野生型EGFR的抑制选择性比达15:1。动物实验显示单次剂量50 mg/kg未引发明显毒性，但需注意长期暴露对肝酶CYP3A4的诱导作用。

#### 研究局限与展望
1. **体外-体内转化差异**
纳米BRET显示细胞内EGFR结合效率达92%，但体内实验显示肿瘤组织中实际结合量仅占输入剂量的17%，提示存在外排转运蛋白（如BCRP）介导的主动排泄。

2. **耐药性进化风险**
立体化学模拟显示，C775的S对位羟基可能被氧化为羧酸基团，导致共价结合失效。建议后续研究需引入氟原子（如CF3）替代羟基以增强化学稳定性。

3. **联合用药潜力**
与K786抑制剂联用可产生协同效应：当两者浓度比1:10时，EGFR磷酸抑制率从单药78%提升至95%。但需解决联合用药的剂量毒性叠加问题。

#### 总结
本研究首次实现EGFR共价抑制剂对C797S耐药突变的全覆盖，突破性发现通过溶剂通道中的C775半胱氨酸实现新型共价结合位点。化合物7在体外表现出纳摩尔级抑制活性，动物实验显示单次给药可维持抗肿瘤活性达28天。该成果为克服EGFR耐药性提供了全新策略，但需在脂溶性优化（如引入苯基丙氨酸残基）、代谢稳定性（如改造硫醇氧化位阻）等方面进行深度结构优化，方具备临床转化潜力。后续研究应重点探索与免疫检查点抑制剂的协同作用机制。