《Aquaculture》：Immersion-based infection model of nervous necrosis virus in
Oryzias pectoralis
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神经坏死病毒（NNV）感染模型构建。研究发现胸腺鲌（Oryzias pectoralis）成鱼可通过注射和浸泡感染NNV，并在脑、视网膜中完成病毒复制，证实其作为病毒宿主的高敏感性。该模型解决了传统经济鱼类幼虫供应不稳定难题，同时模拟自然传播途径，为病毒-宿主互作机制研究提供可靠工具。
黄润清|刘琳|邱思琪|叶坤|尹卓彦|曾晓晴|陈新月|严学忠|王江勇
广东省惠州市惠州大学理学院，邮编516007，中国
摘要
迄今为止，一些经济价值较高的鱼类（如石斑鱼、海鲈鱼和隆头鱼）的幼体常被用作神经坏死病毒（NNV）研究的感染动物。然而，幼体供应的不稳定性阻碍了病毒-宿主相互作用研究的进展。尽管斑马鱼（Danio rerio）和青鳉鱼（Oryzias latipes）的幼体可以通过浸泡方式被NNV感染，但这些物种的成体对该病毒并不敏感。在本研究中，我们发现Oryzias pectoralis可以通过注射和浸泡两种方式被NNV感染，表明其对这种病毒具有敏感性。通过RT-PCR、免疫荧光检测、透射电子显微镜观察以及病毒重新分离，证实了O. pectoralis的大脑和视网膜中病毒的成功复制。浸泡感染途径与NNV的自然传播方式非常相似。O. pectoralis是一种小型淡水鱼，在实验室条件下易于饲养。在O. pectoralis中建立基于浸泡的NNV感染模型，为研究NNV的致病机制提供了一个便捷且有价值的系统。
引言
神经坏死病毒（NNV）属于Nodaviridae科和Betanodavirus属，是引起病毒性脑病和视网膜病变（VER）的病原体（Yoshikoshi和Inoue，1990；Low等人，2017）。据报道，NNV可以感染120多种海洋和淡水鱼类，导致多种水产养殖物种大量死亡，并造成巨大的经济损失（Hegde等人，2003；Keawcharoen等人，2015；Costa和Thompson，2016；Bandín和Souto，2020）。在过去三十年中，已经建立了多种对NNV敏感的细胞系（Yoshikoshi和Inoue，1990；Breuil等人，1991；Glazebrook等人，2010）。此外，目前有许多基于常见经济鱼类的动物感染模型可用于NNV研究。由于这些物种的成体对NNV不敏感，因此通常使用石斑鱼、海鲈鱼和隆头鱼的幼体作为NNV的感染动物（Liu等人，2016；Kim等人，2017；Kim等人，2021）。尽管这些幼体具有实用性，但由于其供应有限且仅在一年中的某些时期可用，研究进展受到了严重阻碍。此外，作为常见模式生物的斑马鱼似乎对NNV不敏感，在肌肉注射感染后没有表现出异常游动行为，且大脑中也没有检测到病毒蛋白信号（Furusawa等人，2007）。到目前为止，青鳉鱼（Oryzias latipes）似乎是最理想的NNV宿主，因为肌肉注射感染的青鳉鱼表现出与自然感染海洋鱼类相似的感染特征，如异常游动和大脑中高病毒载量（Yoshikoshi和Inoue，1990；Mori等人，1992；Furusawa等人，2006）。值得注意的是，只有新孵化的青鳉鱼在NNV浸泡处理后会出现死亡，而成体则不会（Furusawa等人，2006；Kitamura等人，2017）。这表明成体青鳉鱼不能通过浸泡这种水平传播方式被NNV感染，而浸泡是NNV的自然传播途径之一（Péducasse等人，1999；Castri等人，2001；Toffolo等人，2007；Souto等人，2015）。在本研究中，我们发现成体O. pectoralis可以通过肌肉注射和浸泡两种方式被NNV感染，表明O. pectoralis是这种病毒的高度敏感宿主。通过RT-PCR、免疫荧光检测和透射电子显微镜观察，证实了NNV在大脑和视网膜中的复制。此外，还从先前通过浸泡感染NNV的死亡鱼类中重新分离出了病毒。在O. pectoralis中通过浸泡成功感染NNV表明，该物种可以作为模拟自然病毒感染过程的理想模型动物。在O. pectoralis中建立基于浸泡的NNV感染模型，为进一步研究病毒-宿主相互作用提供了便捷的体内系统。
章节片段
鱼类、细胞、病毒和试剂
O. pectoralis是从中国广东省肇庆市的一条小河中捕获的（E112°20′44″/N22°59′57″），并在实验室中用25°C的淡水饲养。这些鱼每天喂食两次常见的青鳉鱼饲料。本研究中使用的成体O. pectoralis（平均体重：0.21±0.05克，平均体长：2.23±0.21厘米，平均总长度：2.98±0.24厘米）。从SSN-1细胞亚克隆得到的SC1细胞在添加了10% FBS的L-15培养基中于27°C下培养，并用于
O. pectoralis
的形态学和分子鉴定本研究中使用的实验鱼是从野外捕获的。实验鱼的形态与Wei-Ming和Jian-Zhong（2017）描述的O. pectoralis的形态相似。O. pectoralis的显著外观特征包括胸鳍基部有明显的黑色斑块、圆形的尾鳍以及每个尾鳍叶之间的黄色至橙色边缘条纹（图1A）。此外，
讨论
在自然宿主体内，NNV通常在幼体和幼鱼中引起急性感染，伴随异常螺旋游动、皮肤色素沉着加深、大规模死亡以及大脑和视网膜的显微病变等症状。相比之下，在成鱼中则表现为慢性感染，且没有明显症状（Low等人，2017；Wang等人，2021）。研究人员通常使用经济价值较高的海洋鱼类的幼体来建立NNV感染模型。然而，季节性因素
作者贡献声明
黄润清：撰写初稿、项目管理、方法学设计、实验实施、资金获取、数据管理、概念构思。刘琳：验证、方法学设计、实验实施。邱思琪：验证、方法学设计、实验实施。叶坤：验证、方法学设计、实验实施。尹卓彦：验证、数据分析、数据管理。曾晓晴：验证、数据分析。陈新月：验证、数据分析。严学忠：验证、数据分析。
利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：
黄润清报告称获得了惠州大学的财务支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
