美墨边境痰样本中表型1G检测法精准诊断结核分枝杆菌及耐药性的研究

《The Journal of Infectious Diseases》：Accuracy of the phenotypic 1G test to detect Mycobacterium tuberculosis and drug resistance from sputa in the US-Mexico border

本刊推荐：为解决结核病(TB)诊断和耐药性检测(DST)在资源有限地区缺乏简便、准确方法的问题，研究人员开展了针对低复杂度表型1G检测法的准确性评估研究。结果表明，1G检测法对结核分枝杆菌(Mtb)检测灵敏度≥98%，对异烟肼(INH)、利福平(RIF)和莫西沙星(MFX)的耐药性检测灵敏度达100%，且污染率低于MGIT培养法。该研究为缺乏分子诊断工具的基层诊所提供了实用的表型诊断替代方案。

　　

结核病（Tuberculosis, TB）至今仍是全球最严重的传染病威胁之一，2023年估计有1080万新发病例和125万死亡病例。尽管在诊断技术、抗结核治疗方案和公共卫生干预方面取得了进步，TB仍然是全球健康的重大挑战，这一问题在低收入和中等收入国家尤为突出。这些地区有限的医疗资源和社会经济差异阻碍了有效的疾病控制。

阻碍结核病防治的一个关键障碍是日益加重的耐药结核病（Drug-Resistant TB, DR-TB）负担。其中，耐多药结核病（Multidrug-Resistant TB, MDR-TB）指对利福平（Rifampicin, RIF）和异烟肼（Isoniazid, INH）同时耐药；准广泛耐药结核病（pre-extensively DR-TB, pre-XDR-TB）则在MDR-TB基础上对氟喹诺酮类药物耐药；广泛耐药结核病（Extensively drug-resistant TB, XDR-TB）的耐药范围更广。导致DR-TB的因素包括治疗依从性差和抗结核药物的不规范使用。此外，传统的诊断方法，如痰涂片抗酸杆菌（Acid-Fast Bacilli, AFB）镜检，灵敏度较低。而像罗氏培养（Lowenstein-Jensen, LJ）和BACTEC分枝杆菌生长指示管（Mycobacteria Growth Indicator Tube, MGIT）这样的培养技术虽然是结核杆菌检测和药物敏感性试验（Drug Susceptibility Testing, DST）的金标准，但耗时长且资源密集。这些诊断上的缺口导致治疗延迟，并加剧了DR-TB的传播。

分子诊断技术显著缩短了结核病诊断时间，并能检测耐药机制。然而，高昂的成本、基础设施要求以及专业人员的需求限制了其在中低收入地区的普及。因此，迫切需要简单、快速且廉价的诊断工具来改善结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）及其耐药性的检测。

这些结核病控制的挑战在中小城市或农村地区尤为突出，这些地区的大多数患者仅根据经验接受药物敏感（Drug-Susceptible, DS）结核病治疗，药物敏感性试验仅用于高危人群。例如，在墨西哥，分散的门诊结核病诊所通常基于临床表现、痰涂片AFB阳性（如果可用，还有胸部X光片）来确诊结核病。当怀疑DR-TB时，痰样本需送往墨西哥城进行DST，导致结果延迟数月。Xpert MTB/RIF（Cepheid）检测仅用于特定病例。这些限制阻碍了及时治疗，促进了社区传播并增加了死亡率。以墨西哥塔毛利帕斯州北部卫生管辖区为例，其结核病发病率至少是相邻美国德克萨斯州各县的3倍（2022年分别为35例/10万人 vs 11例/10万人）。

在此背景下，一项发表在《The Journal of Infectious Diseases》上的研究，评估了一种名为第一代（1G）表型检测法（也称为Color-test, CX-test, TB-CX）的准确性。这是一种低成本、基于四象限的薄层琼脂平板培养法，用于同时检测Mtb以及对三种选定药物的耐药性。该培养基有利于Mtb加速生长，并通过红色菌落进行判读。其设备要求极低，使其适用于结核病流行地区，包括农村区域。此前在埃塞俄比亚、马拉维和莫桑比克的初步实地研究中，该1G检测法能在中位14天内从痰液中检测出耐药Mtb，并且与LJ培养、LJ-DST（针对INH和RIF）或Xpert MTB/RIF的一致性超过97%。然而，1G检测法在痰液样本中的性能尚未与MGIT和MGIT-DST进行直接比较，后者是目前最敏感、最快速的表型方法，但存在污染率高、设备要求高以及复杂的两步法DST协议等限制。

本研究旨在评估1G检测法是否能成为MGIT结合DST的一种准确且实用的替代方案，研究样本来自与美国德克萨斯州接壤的墨西哥小城市的疑似结核病患者。

为开展此项研究，研究人员采用了横断面诊断和DST准确性研究设计，纳入了基于临床症状（如咳嗽超过2周等）且在开始结核治疗7天内的成年疑似肺结核患者。研究收集了社会人口学和医学信息。痰样本在结核病诊所冷藏，每周运送至实验室。痰液经过标准消化去污染处理（NALC-NaOH法）或一种替代的盐混合去污染（Salt-mix decontamination, SMD）法。核心的实验技术方法包括：1）1G表型检测法，使用四象限平板同时进行Mtb生长检测和INH、RIF、MFX的DST；2）常规表型方法作为参照，包括痰AFB涂片镜检、手动MGIT培养、自动化MGIT-960系统培养；3）以MGIT-960 DST作为金标准，评估1G检测法对INH、RIF和MFX的耐药性检测准确性；4）统计学分析采用Cohen's kappa系数评估一致性，并计算检测的敏感性和特异性等指标。

研究结果

参与者特征

研究共评估了426名疑似结核病参与者的痰液样本。所有参与者自我识别为西班牙裔白人，中位年龄43岁，约三分之二为男性。常见的合并症包括2型糖尿病（44%）、自我报告的大血管疾病（22%）和HIV血清阳性（6%）。社会风险因素包括过度饮酒（17%）和频繁使用娱乐性药物（21%）。16%的参与者报告有既往结核病史。

痰液去污染方案比较

在一项子分析中，研究人员比较了传统的NALC-NaOH法和SMD法对痰液的处理效果。在35份并行处理的痰液中，两种方法在Mtb生长检测上表现出100%的一致性。使用经历一次冻融循环的样本时，Mtb生长的中位检测时间（Time to Detection, TTD）相近：NALC-NaOH法为14.5天，SMD法为14天。鉴于两种处理方法性能相当，后续将所有426份样本的1G检测结果与常规方法进行比较时，合并分析了不同处理方法的样本。

1G检测法对Mtb检测的灵敏度

在分析的426份痰液中，1G检测法在377份（88.5%）中检测到Mtb阳性。与不同参照方法相比，1G检测法表现出极高的灵敏度：相对于AFB痰涂片阳性（n=346），灵敏度为99.7%；相对于手动MGIT培养阳性（n=277），灵敏度为99.6%；相对于自动化MGIT-960培养阳性（n=71），灵敏度为98.6%；相对于两种MGIT方法 combined，灵敏度为99.4%。此外，1G检测法还检测到了29份AFB涂片阴性、18份培养阴性以及6份MGIT培养污染的样本中的Mtb。当与复合参照标准（涂片或任一MGIT培养阳性）比较时，1G检测法的灵敏度保持在98.9%。有8份痰液样本仅1G检测法阳性。1G检测法的污染率（3.5%）显著低于自动化MGIT-960系统（8.1%）。

1G检测法对Mtb DST的准确性

在377份1G检测Mtb阳性的痰液中，有376份成功获得了对RIF和INH的同步DST结果（一份在含药象限污染）。对MFX的DST测试了310份样本。在376份样本中，52份（14%）对至少一种药物耐药：41份对INH耐药，16份对RIF耐药，12份对MFX耐药。为评估1G DST的准确性，研究人员将可用的耐药Mtb分离株（n=51）进行MGIT-DST作为金标准比对。最终分析了49份耐药株和19份由1G检测法判为药物敏感（DS）的匹配对照株。结果显示，1G检测法对INH、RIF和MFX的耐药性检测灵敏度均为100%。特异性分别为：INH 94%、RIF 91%、MFX 97%。一致性分析显示，对任何药物耐药、INH耐药和MFX耐药的kappa值分别为0.86（高度一致）、0.94（几乎完全一致）和0.97（几乎完全一致），对RIF耐药的kappa值为0.76（高度一致）。

Mtb检测和DST的检测时间（TTD）

对于1G检测法，使用经历一次冻融（-20°C）的痰液时，同时检测Mtb生长和DST的中位时间为14天；若痰液经历二次冻融，中位TTD延长至16-18天。所有1G检测的中位TTD为17天。相比之下，AFB涂片镜检需2天；手动MGIT培养初步评估需14天，加上在LJ斜面上确认Mtb生长，总周转时间约42天，且不提供DST结果；自动化MGIT-960系统检测Mtb生长需7±3天，后续DST还需稀释和次代培养到含药管中，再孵育12-14天，这种两步法MGIT-DST协议从初始痰液培养起总计需要19-21天。

美墨边境墨西哥城市DR-TB的流行病学特征

基于1G检测法的DST结果，研究人员描述了研究人群中DR-TB的流行病学模式。任何DR-TB的患病率为14%，其中INH耐药率为11%，RIF或MFX耐药率均为4%。单药耐药情况为：INH单耐7%，RIF单耐0.3%，MFX单耐3%。MDR-TB患病率为3%，pre-XDR TB（MDR加上MFX耐药）患病率为0.6%。逻辑回归分析未发现宿主特征与DR-TB存在显著关联。

研究结论与讨论

本研究在墨西哥与德克萨斯州接壤的小城市结核病诊所评估了1G检测法，这些地区本地无法进行DR-TB检测，仅对高危人群转诊至中心诊所。研究发现，1G检测法具有以下优势：i) 对Mtb检测的灵敏度高于手动MGIT培养（多检出18份阳性），与自动化MGIT培养相当；ii) 污染率更低；iii) 与MGIT-DST在INH、RIF和MFX的DST上有良好的一致性，且具有污染少、结果更快、协议更简单的额外优势；iv) 对Mtb的TTD相似，但对DST的TTD短于自动化MGIT-DST；v) 与MGIT-DST需要额外耗材、人员和设备相比，1G检测法是一个简单的一步法过程。

总之，1G检测法是一种低复杂度的表型结核病诊断工具，为Mtb检测和DST（如LJ或MGIT结合DST）提供了实用的替代方案。其简单性使其适合在结核病负担中高的地区的分散实验室使用，这些地方通常具备涂片镜检能力、生物安全柜，但分子检测因成本高和资源有限而不可行。此外，虽然分子检测靶向耐药相关突变，但仍有一些DR-TB病例只能通过表型方法检测到。

研究的局限性包括并非所有样本都同时进行1G检测和常规方法测试（部分样本经历了二次冻融），但这仅使1G检测的TTD中位数延迟了三天。尽管对1G检测法判为全敏感的Mtb分离株子集进行MGIT-DST验证显示完全一致，但不能排除遗漏了仅由MGIT-DST能检出的独特耐药株的可能性。基于1G检测法得出的社区RIF耐药率高于MGIT-DST，需谨慎解读。此外，大多数研究参与者AFB涂片阳性，结论需考虑此潜在偏倚。

综上所述，本研究结果支持1G检测法作为一种准确、简单且经济的选择，可在资源有限的高负担环境下替代当前的表型检测方法。在中心化或分散化的诊所中，与痰涂片镜检并行使用，它可以提高分枝杆菌检测的灵敏度并实现DST，特别是在像GeneXpert这样的分子工具未获补贴的地区。未来的研究有必要评估1G检测法在缺乏分子诊断能力的分散诊所中的实施情况，并可探索进行简单改良，如使用SMD法、使用移液管混合以减少气溶胶产生、以及在室温下孵育等。