甲烷古菌Mtr复合体的高分辨率结构揭示其氧应激响应调控新机制

《Nature Communications》：Structure of the Methanosarcina mazei Mtr complex bound to the oxygen-stress responsive small protein MtrI

本研究针对产甲烷古菌能量代谢核心元件——钠离子转运甲基转移酶复合体（Mtr）的结构与调控机制这一关键科学问题，通过单颗粒冷冻电镜技术解析了Methanosarcina mazei菌株Mtr复合体2.1 ?分辨率的三维结构，首次发现并鉴定了由小开放阅读框编码的氧应激响应蛋白Mtrl，该蛋白通过结合MtrA胞质结构域的钴胺素辅因子，在氧化条件下稳定复合体并阻断钠离子泄漏通道，为理解甲烷古菌在富氧环境中的适应性进化提供了全新视角。

　　

在地球生命的隐秘角落，存在着一类独特的微生物——产甲烷古菌。它们栖息在严格厌氧的环境中，如湿地底部、动物肠道和深海沉积物，每年向大气释放约10亿吨甲烷，对全球碳循环和气候变化产生深远影响。这些古老微生物的能量代谢核心是一个神秘的膜蛋白复合体：N⁵-四氢甲烷蝶呤：辅酶M甲基转移酶（Mtr）。这个复合体催化甲基在两种甲烷古菌特有辅因子间的转移，同时驱动钠离子跨膜转运，构成了氢营养型甲烷生成过程中唯一的能量守恒步骤。

尽管科学家对Mtr复合体的研究已超过三十年，但其精细结构和调控机制始终笼罩在迷雾中。先前的研究仅获得了膜亚基的部分冷冻电镜结构和MtrA穿梭域的晶体结构，缺乏完整复合体的高分辨率结构信息。更令人困惑的是，甲烷八叠球菌目（Methanosarcinales）的成员能够栖息在频繁接触氧气的环境中，如湿地和含氧沉积物，这表明它们可能进化出了独特的氧化应激应对机制。这些未解之谜促使Tristan Reif-Trauttmansdorff等研究人员展开了对Mtr复合体结构的深入探索。

研究人员在《Nature Communications》上发表了题为"Structure of the Methanosarcina mazei Mtr complex bound to the oxygen-stress responsive small protein Mtrl"的研究论文，通过单颗粒冷冻电镜技术解析了Methanosarcina mazei菌株Mtr复合体2.1 ?分辨率的三维结构，意外发现了一个由小开放阅读框编码的氧应激响应蛋白Mtrl，揭示了甲烷古菌能量代谢调控的新机制。

关键技术方法

研究团队通过构建C端带有TwinStrep标签的MtrE表达质粒，在Methanosarcina mazei中实现Mtr复合体的表达，采用月桂基麦芽糖新戊二醇（LMNG） detergent进行膜蛋白 solubilization，通过Strep-Tactin affinity purification获得高纯度复合体。利用冷冻电镜单颗粒分析技术获得高分辨率结构，结合质谱分析验证蛋白组成和相互作用。通过电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析金属结合特性，并利用比较基因组学探究Mtrl的进化保守性。

Mtr复合体呈现独特的苜蓿叶形结构

研究显示，Mtr复合体由三个异源九聚体原体组成，每个原体包含三个多跨膜螺旋亚基（MtrC、MtrD、MtrE）、四个单跨膜螺旋亚基（MtrA、MtrB、MtrF、MtrG）和一个二聚化的胞质甲基转移酶MtrH。这种排列形成了三聚体核心，呈现出独特的三叶草形结构。中央茎部由MtrABFG亚基构成，延伸至胞质区域，形成了防止离子泄漏的疏水密封。研究还发现复合体中嵌入了至少15个古菌醚脂分子，这些脂质作为结构性组分稳定了跨膜亚基间的相互作用。

二聚化甲基转移酶MtrH的识别机制

结构分析表明，MtrH以同源二聚体形式存在，每个单体采用三磷酸异构酶（TIM）桶状折叠。三个MtrH二聚体与复合体结合，通过MtrB的N端β-片层实现精确定位。虽然底物H₄SPT未在结构中出现，但与同源甲基转移酶MtgA的叠加分析揭示了高度保守的蝶呤结合位点，表明其识别机制的保守性。

MtrCDE三聚体与钠离子结合位点

在膜区域，每个MtrCDE三聚体通过MtrE与中央茎部广泛相互作用。尽管MtrC、MtrD和MtrE具有相似的整体结构，但序列同一性较低，提示它们从共同祖先分化而来并承担专门化功能。研究在MtrE中发现了一个钠离子结合位点，由Asp183、Glu60和Ser28等残基通过八面体几何构型协调钠离子，这一发现与先前在Methanothermobacter marburgensis中提出的钠结合模式一致。

Mtrl连接MtrAcyt和MtrCDE的创新发现

最令人惊讶的发现是，MtrA的钴胺素结合结构域（MtrAcyt）并不直接与膜整合的MtrCDE亚复合体相互作用，而是通过一个此前未注释的小蛋白Mtrl作为桥梁。Mtrl由仅68个氨基酸组成，其C末端深入MtrCDE亚基形成的空腔，有效阻断了中央空腔。同时，Mtrl的Cys40残基直接配位Factor III（FIII）钴胺素辅因子的钴原子，形成上轴向配体，而MtrA的His85作为下轴向配体，表明钴处于氧化的Co(III)状态。

Mtrl结合具有氧化还原依赖性和氧气诱导特性

功能研究表明，Mtrl的结合具有明显的氧化还原依赖性。在氧气暴露条件下纯化的Mtr复合体呈现粉红色（指示Co(III)状态），并检测到较高水平的Mtrl结合；而在严格厌氧条件下纯化的样品呈棕色（指示Co(II)或Co(I)状态），Mtrl结合水平显著降低。这种氧化还原依赖性结合提示Mtrl可能作为氧气传感器，在氧化应激条件下稳定Mtr复合体。

研究结论与意义

这项研究不仅提供了Mtr复合体的高分辨率结构视角，还揭示了一个全新的调控层面：小蛋白对核心生物能量复合体的精细调控。Mtrl作为氧应激响应因子，通过识别MtrA中氧化的钴胺素辅因子，在氧化条件下稳定复合体并防止钠离子泄漏，这可能是甲烷八叠球菌目适应含氧环境的关键进化策略。

该研究的突破性在于将结构生物学与功能研究相结合，不仅解决了长期存在的Mtr复合体结构问题，还发现了小蛋白在古菌能量代谢中的新型调控功能。这一发现扩展了我们对微生物适应性机制的理解，为研究其他厌氧微生物在氧化环境中的生存策略提供了新范式。同时，研究中使用的高分辨率冷冻电镜方法和结构解析策略，为今后研究复杂膜蛋白复合体设立了新标准。