从蜕皮残骸探寻生命密码：两栖昆虫蜕壳DNA宏条形码技术的开发与应用

《The Canadian Entomologist》：What we can find in what’s left behind: DNA metabarcoding of amphibiotic insect exuviae

本研究针对传统昆虫羽化研究方法的局限性，开发了一种基于蜕壳（exuviae）DNA宏条形码（DNA metabarcoding）的非侵入性监测技术。通过对比传统羽化陷阱法与蜕壳采集法，研究发现蜕壳样本能检测到更高的两栖昆虫目级多样性和科级丰富度，尤其对光照敏感的类群（如蜻蜓目Odonata）更具优势。该技术为生态系统连通性研究和生物多样性评估提供了创新工具，显著降低了对研究种群的影响。

　　

在淡水生态系统中，约有2%的昆虫种类其生命历程跨越水生与陆地两个阶段，这些被称为两栖昆虫的生物群体，通过羽化过程将水体中的物质和能量输送至陆地环境，成为维系生态系统连通性与功能的关键环节。然而，传统研究主要依赖羽化陷阱捕获刚羽化的成虫并进行形态学鉴定，这种方法不仅耗时费力，更可能对昆虫种群造成干扰，在保护区或涉及濒危物种的研究中受到限制。随着对昆虫福利关注的提升以及非侵入性研究理念的推广，开发新的监测方法显得尤为迫切。

在此背景下，发表于《The Canadian Entomologist》的一项概念验证性研究另辟蹊径，将目光投向了昆虫羽化后残留的蜕壳。当两栖昆虫幼虫羽化为成虫时，会蜕下其外骨骼（即蜕壳），这些蜕壳通常能在水面漂浮数日。研究人员设想，这些看似无生命的残骸中是否留存有足够的DNA痕迹，足以用于物种鉴定？为此，研究团队系统比较了传统羽化陷阱法与蜕壳采集法在监测两栖昆虫群落方面的效果。

为了验证蜕壳DNA宏条形码技术的可行性，研究团队于2023年5月至8月在加拿大安大略省西南部的一个池塘和一条小溪进行了样本采集。他们每周收集一次羽化陷阱样本（共40份）和蜕壳样本（共26份）。羽化陷阱为金字塔形，覆盖部分水面，捕获羽化中的成虫；蜕壳样本则通过筛网从水面收集漂浮的蜕壳。所有样本均用95%乙醇保存。最终，28份陷阱样本和14份蜕壳样本成功进行了后续分析。

关键技术方法包括：1) 样本采集：分别使用羽化陷阱和人工筛网从池塘和溪流收集昆虫成虫和蜕壳；2) DNA提取与扩增：采用改良的裂解流程和DNeasy Blood and Tissue Kit提取DNA，并通过两轮PCR扩增细胞色素c氧化酶亚基I（COI）基因片段；3) 高通量测序与生物信息学分析：使用Illumina MiSeq平台测序，通过APSCALE软件进行序列过滤和聚类，以3%的遗传距离阈值界定操作分类单元（OTUs），并利用Barcode of Life Data System的加拿大参考库进行物种注释。

研究结果

样本采集与DNA质量

池塘环境中收集到的蜕壳数量（32±6.97）显著高于溪流环境（8.17±1.19）。蜕壳样本的DNA浓度（5.66±1.33 ng/μL）和测序读长数（5320±1817）均显著低于羽化陷阱样本（浓度23.4±2.87 ng/μL，读长41089±7016），这表明蜕壳中的DNA确为残留痕迹。尽管如此，两种样本类型的物种鉴定能力并未显示出统计学上的显著差异。

物种组成与多样性

测序共获得968,976条有效读长，定义了288个OTUs。羽化陷阱样本中检测到206个OTUs，蜕壳样本中检测到117个OTUs，两者共有OTUs极少。在池塘样本中，两种方法的OTUs丰富度无显著差异（陷阱样本13.1±1.26，蜕壳样本12.8±3.92）。双翅目（Diptera）是两者中最主要的类群，在陷阱样本和蜕壳样本中分别占总检测量的74%和60%，其中摇蚊科（Chironomidae）占主导地位。然而，蜕壳样本在揭示更高阶元多样性上表现出优势：它检测到了6个包含两栖昆虫的目（双翅目、蜉蝣目Ephemeroptera、蜻蜓目Odonata、鳞翅目Lepidoptera、广翅目Megaloptera、毛翅目Trichoptera），而陷阱样本仅检测到4个目（双翅目、蜻蜓目、襀翅目Plecoptera、毛翅目）。在共有目中，蜕壳样本显示出更高的科级多样性，例如在蜻蜓目中检测到4个科，而陷阱样本仅检测到1个科。

物种生态类型与群落差异

蜕壳样本中两栖昆虫读长比例显著高于非两栖昆虫，而陷阱样本中两者无显著差异，提示蜕壳样本受环境（如随风而来的陆地昆虫）污染可能更小。Beta多样性分析表明，群落组成差异主要来源于物种替换而非物种缺失。非度量多维尺度分析（NMDS）显示，采样地点（池塘vs溪流）对物种组成有显著影响（r²=0.302, P=0.005），而采样方法（陷阱vs蜕壳）的影响处于边际显著水平（r²=0.137, P=0.098）。位于池塘不同位置的三个陷阱其物种组成高度相似，表明蜕壳的漂流可能不会对基于较大空间尺度的生态分析产生实质性影响。

研究结论与意义

本研究成功证明，利用DNA宏条形码技术分析两栖昆虫蜕壳中残留的DNA，是一种有效且可靠的非侵入性监测方法。尽管蜕壳中的DNA含量较低，但其鉴定类群的能力与羽化陷阱相当，甚至在揭示更高阶元（如目、科）多样性方面更具优势。研究人员分析，传统羽化陷阱可能因其结构（如遮挡阳光）而偏向于收集那些不依赖强光条件羽化的类群（如夜间羽化的毛翅目Hydropsychidae、襀翅目），而蜕壳采集法则能更全面地反映包括那些需要攀附植被或在阳光下羽化（如许多蜻蜓目昆虫）的类群在内的整个昆虫群落。

该技术的成功开发为生态学和保护生物学研究提供了重要新工具。它不仅减少了对研究种群的人为干扰，符合动物伦理和非侵入性研究的发展趋势，而且为长期、大范围监测两栖昆虫的物候变化、生物多样性以及评估气候变化和人类活动对淡水生态系统的影响提供了可行、高效的技术手段。未来研究可进一步优化在流水环境等不同水体条件下的蜕壳采集方法，以提升该技术的普适性和可靠性。总之，这项研究标志着对昆虫羽化的探索进入了一个从“捕捉生命”到“解读痕迹”的新阶段，为理解和保护水生-陆地生态系统连通性开辟了富有前景的道路。