《Neurobiology of Learning and Memory》：Ensembles and engrams in mouse cortical and sub-thalamic brain regions supporting context and memory recall
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本研究通过TRAP2技术，在雄性和雌性小鼠中系统探究前额叶皮层下回（IL-PFC）和下丘脑外侧区（ZI）的细胞群动态，发现雄性IL-PFC语境相关细胞群密度显著更高，而雌性恐惧回忆时新激活细胞群比例更突出，且两组在IL-PFC与ZI的关联模式上呈现性别特异性差异。研究首次明确区分了语境与线索关联记忆的细胞群编码机制，并揭示了性别影响神经编码网络的关键特征。
威廉·W·泰勒（William W. Taylor）| 高薇娜（Vienna Gao）| 劳拉·科罗布科娃（Laura Korobkova）| 布赖恩·G·迪亚斯（Brian G. Dias）
美国加利福尼亚州洛杉矶南加州大学神经科学研究生项目
摘要
联想学习有助于理解与情境和线索相关的结果。在学习过程中，活跃的细胞群可以被纳入记忆痕迹中，并在后续被重新激活以支持记忆的回忆。探索记忆痕迹形成和重新激活的研究主要使用小鼠进行情境条件反射实验，但很少区分支持情境信息的学习与回忆的细胞群与支持线索相关学习的细胞群。此外，这类分析通常忽略了性别差异对细胞群动态的影响。通过使用听觉恐惧条件反射和活动依赖性标记技术，我们试图区分与情境相关的细胞群与与线索相关学习的细胞群，并分析潜在的性别差异。具体来说，我们量化了在情境暴露、恐惧回忆、消退训练以及消退回忆过程中，支持学习和记忆的皮层和下丘脑脑区的细胞活动。研究发现，雄性小鼠在情境暴露时下边缘前额叶皮层（IL-PFC）中的活跃细胞群更为密集，而雌性小鼠在恐惧回忆时IL-PFC中新激活的细胞比例显著更高。我们还发现了IL-PFC与不确定区（ZI）之间活动的相关性存在性别差异。无论性别如何，IL-PFC中的细胞重叠更为密集，且消退记忆痕迹的重新激活程度也更高。这些结果强调了区分支持情境信息的细胞群与编码线索相关记忆的细胞群的重要性，并突显了细胞群动态中的性别差异。
引言
将情境和环境线索与结果联系起来，随后回忆这些关联，对于生存和我们的日常生活至关重要。最近的研究表明，在联想学习过程中，一组神经元（即细胞群）会被激活，其中一部分神经元会形成记忆痕迹（记忆痕迹），这些痕迹在后续会被重新激活以支持记忆的回忆（Frankland等人，2019；Frankland等人，2024；Guskjolen和Cembrowski，2023；Josselyn和Tonegawa，2020）。进一步支持这些细胞群和记忆痕迹在成功学习和回忆中作用的研究包括在特定情境下标记细胞，或当特定线索与厌恶或愉悦结果相关联时调节其活动。总体而言，沉默之前已被纳入记忆痕迹的细胞会显著干扰记忆回忆，而激活这些细胞则可以独立于学习时遇到的任何条件或线索引发学习行为的表达（Cowansage等人，2014；Han等人，2009；Hsiang等人，2014；Josselyn和Tonegawa，2020；Lacagnina等人，2019；Liu等人，2012；Redondo等人，2014；Tanaka等人，2014；Vetere等人，2019）。这些研究共同证实了记忆痕迹是大脑中重要的记忆单位，它们负责编码学习内容并支持记忆回忆。
尽管在记忆细胞群和痕迹的研究方面取得了很大进展，但仍有三个方面需要更多关注。首先，记忆细胞群和痕迹主要在由海马体、前额叶皮层和杏仁核组成的经典恐惧回路中进行研究（Venkataraman和Dias，2023）。我们逐渐认识到，前额叶皮层-杏仁核-海马体经典回路之外的脑区，特别是下丘脑区域（如不确定区），在正常的联想学习中也起着重要作用（Chou等人，2018；Venkataraman和Dias，2023；Venkataraman等人，2019；Venkataraman等人，2021）。不确定区还与经典恐惧回路（包括前额叶皮层）高度连接（Chou等人，2018；Zhao等人，2020）。不确定区的这一新兴作用及其连接性表明，可能存在与经典区域（如前额叶皮层）相关的学习和记忆细胞群。其次，迄今为止，大多数研究几乎没有区分编码情境信息的细胞群与支持线索关联的细胞群，尽管这两种细胞群是记忆的不同组成部分。第三，尽管在创伤后应激障碍（PTSD）等神经精神障碍的学习和记忆相关维度中存在性别差异（Lebron-Milad和Milad，2012；Ramikie和Ressler，2018；Velasco等人，2019），但关于细胞群和痕迹动态的性别差异的研究仍然不足。
为了扩展我们对细胞群和痕迹的研究，我们将研究范围扩展到下丘脑的不确定区及其与前额叶皮层的连接，并考虑情境、线索和性别对学习和记忆的影响，我们训练了TRAP2（靶向活性细胞组合）转基因小鼠（floxed-tdTomato），使它们将情境A中的条件刺激（CS+）音调呈现与轻微的足部电击联系起来。接下来，我们激活TRAP2系统（DeNardo等人，2019），在两种条件下标记细胞：一种是在仅暴露于情境B时而不进行消退训练（情境组）；另一种是在消退训练期间，动物在情境B中暴露于CS+音调呈现但没有足部电击（消退组）。这种基因标记方法使我们能够捕捉并区分在这些实验条件下激活的细胞群。最后，在情境B中无足部电击的情况下呈现CS+后，我们对C-FOS进行了染色，这构成了情境组的恐惧回忆测试和消退组的消退回忆测试。这种方法使我们能够研究在情境暴露、消退训练、恐惧回忆以及不确定区（ZI）、前边缘前额叶皮层（PL-PFC）和下边缘前额叶皮层（IL-PFC）中的细胞群大小和重新激活模式。简而言之，我们的结果表明，在情境暴露期间IL-PFC中的细胞群大小存在性别差异，在恐惧回忆期间新激活的IL-PFC细胞群也存在性别差异，以及IL-PFC和ZI中细胞群之间的性别特异性相关性。
实验细节
实验动物
TRAP2小鼠（Fostm2.1(icre/ERT2)Luo/J，品系030323）和floxed-tdTomato报告基因小鼠（B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J，品系007914）来自杰克逊实验室（美国缅因州巴港），并杂交产生用于所有实验的成年雄性和雌性TRAP2/+;floxed-tdTomato/+小鼠（n=15只雌性，14只雄性）。这些小鼠在存在4-羟基他莫昔芬（4OHT）的情况下，可以在CRE表达的细胞中显示tdTomato荧光（补充图1）（DeNardo等人，2019）。
雄性和雌性小鼠在情境暴露和恐惧回忆过程中的行为相似
情境组最初接受了恐惧条件反射训练，包括在情境A中将5次CS+（音调）与无条件刺激（US，足部电击）配对（图1，第1天）。进行了重复测量方差分析（ANOVA），以考察性别和音调呈现对冻结行为的影响。性别没有显著的主效应（F(1,10) = 0.001，p > 0.05）。然而，音调呈现有显著的主效应（F(4, 40) = 32.95，p < 0.001）。事后检验显示，雄性和雌性的冻结行为没有显著差异。
讨论
在学习过程中活跃的细胞群可以被纳入记忆痕迹中。记忆痕迹是特定记忆的独特细胞表征，可以在未来被重新激活以支持记忆回忆。为了研究学习和记忆不同阶段中细胞群的大小和重新激活的潜在性别差异，我们使用TRAP2进行了活动依赖性细胞标记，利用floxed-tdTomato小鼠来确定情境暴露期间细胞的密度和重新激活模式。
CRediT作者贡献声明
威廉·W·泰勒（William W. Taylor）：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，项目管理，方法学，研究设计，数据分析，概念化。高薇娜（Vienna Gao）：可视化，研究设计，数据分析。劳拉·科罗布科娃（Laura Korobkova）：撰写 – 原稿，方法学，数据分析。布赖恩·G·迪亚斯（Brian G. Dias）：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，监督，资源协调，项目管理，资金获取，概念化。
致谢
我们感谢萨班研究所（TSRI）动物护理设施的兽医和工作人员提供的动物饲养和护理支持。BGD的研究得到了美国国立卫生研究院（Grant Nos. R01MH134873和R56MH128427）、南加州大学凯克医学院儿科部门、萨班研究所的发育神经科学与神经遗传学项目以及儿童与大脑发展项目的支持。
