利用假单胞菌（Pseudomonas putida）的代谢工程实现1,2-二氯乙烷和2,4-二氯苯氧乙酸的矿化作用，并将其应用于废水生物修复

《Journal of Environmental Chemical Engineering》：Metabolic engineering of Pseudomonas putida for mineralization of 1,2-dichloroethane and 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and its application in wastewater bioremediation

高效降解双氯乙烯和2,4-滴的工程菌株构建及荧光追踪能力验证。

　　

Xinyu Zhang|Yujie Liu|Ziling Yuan|Haomin Chen|Danyang Ma|Bingzhi Li|Ruihua Liu|Chao Yang

教育部分子微生物学与技术重点实验室，南开大学生命科学学院，天津300071，中国

摘要

本研究旨在修复受1,2-二氯乙烷（DCA）和2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）污染的废水。通过将DCA和2,4-D的矿化途径、绿色荧光蛋白（GFP）以及Vitreoscilla血红蛋白（VHb）植入生物安全菌株Pseudomonas putida KT2440中，构建了一种自荧光工程菌株KTU-DDGV。所有外源基因在KTU-DDGV的传代培养中均稳定存在。RT-PCR证实了KTU-DDGV中所有14个外源基因的成功转录。色谱分析表明，KTU-DDGV能够降解DCA、2,4-D及其中间产物。通过稳定同位素分析进一步验证了KTU-DDGV矿化DCA和2,4-D的能力。当KTU-DDGV与¹³C标记的DCA和2,4-D共培养时，使用同位素质谱仪检测到收集到的气体中含有¹³C标记的CO₂，这表明KTU-DDGV能够将¹³C₂-DCA和¹³C₆-2,4-D转化为¹³CO₂、细胞生物量及细胞成分。在缺氧条件下，KTU-DDGV仍具有共降解DCA和2,4-D的能力。KTU-DDGV在日光下可发出可见的绿色荧光，便于在受污染环境中实时监测其活性。在废水处理过程中，KTU-DDGV保持了高存活率，并表现出优异的DCA和2,4-D矿化效率。本研究突显了KTU-DDGV在原位生物修复DCA和2,4-D污染废水方面的潜力。更重要的是，在一个强大的微生物底盘上构建复合降解途径可能是应对多种有机污染物的有效策略。

引言

1,2-二氯乙烷（DCA）广泛用作工业化学品的原料和中间体，全球每年消耗量超过2000万吨[1],[2]。由于其高迁移性，DCA难以生物降解且容易渗入地下水[2],[3]。2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）作为一种除草剂，被广泛应用于农业中控制阔叶杂草[4],[5]。2,4-D在农业土壤中通常不会长期存在[5],[6]。DCA、2,4-D及其中间产物可能对非目标生物造成神经毒性、内分泌干扰、基因毒性及致癌作用[1],[2],[7],[8]。全球每年产生大量受DCA和2,4-D污染的废水[3],[4]。由于DCA和2,4-D可能通过废水排放进入自然环境，因此亟需开发能够在废水处理系统中高效去除它们的工程菌株[3],[9]。 持久性有机污染物（POPs）的生物修复被认为是清洁环境污染的一种高效、低成本且可持续的方法[9],[10],[11]。为了避免有毒中间产物的积累，可行的策略是通过微生物代谢将POPs转化为CO₂和生物质。目前，已在多种细菌菌株中发现了DCA和2,4-D的好氧生物降解途径，例如Xanthobacter autotrophicus GJ10和Ralstonia eutropha JMP134，并从中鉴定出了相应的降解基因[1],[2],[12],[13],[14],[15],[16],[17]。在X. autotrophicus GJ10中，DCA通过2-氯乙醇、氯乙醛和氯乙酸的顺序转化生成甘油酸，其中关键的酶包括卤代烷脱卤酶（DhlA）、脱氢酶和卤代酸脱卤酶（DhlB）[1],[2],[10]。在R. eutropha JMP134中，2,4-D通过羟基化、环裂解等途径转化为3-氧代脂肪酸，相关的降解基因tfdABCDEF位于内源性质粒pJP4上[13],[14],[15],[16],[17]。 近十年来，合成生物学在环境修复中的应用日益增多[18],[19],[20]。目前，合成生物学与强大的微生物底盘相结合，为污染环境的生物修复开辟了新的途径[21],[22],[23],[24],[25],[26],[27],[28],[29]。生物安全菌株Pseudomonas putida KT2440来源于土壤微生物群落，可用作原位生物修复污染场所的全细胞生物催化剂的开发平台[30],[31],[32],[33]。P. putida KT2440的全基因组功能和代谢网络已得到深入研究[34],[35]。此外，CRISPR-Cas9、λRed重组和自杀质粒介导的同源重组等基因编辑技术在P. putida KT2440中已得到广泛应用[36],[37],[38]。近年来，基于P. putida KT2440通过代谢途径工程改造的工程菌株具备高效降解农药、卤代烷和硝基酚的能力[21],[22],[23],[24],[25],[26]。 本研究通过将异源的DCA和2,4-D降解途径植入P. putida KT2440中，构建了工程菌株KTU-DDGV，并测试了其降解DCA和2,4-D的能力。同时，利用¹³C稳定同位素分析评估了KTU-DDGV将DCA和2,4-D矿化为CO₂的能力。最后，在实际的DCA和2,4-D污染废水系统中进行了修复实验。

试剂、菌株及培养条件

DCA和甘油酸购自中国上海的Aladdin公司。2,4-D、2,4-二氯苯酚（2,4-DCP）、3,5-二氯邻苯二甲酚（3,5-DCC）和氯乙酸购自中国上海的Sigma-Aldrich公司。¹³C标记的底物¹³C₆-2,4-D和¹³C₂-DCA分别购自中国上海的Merck公司和Sigma-Aldrich公司。其他化学品和有机溶剂购自中国天津的Dingguo公司。分子生物学试剂盒购自南京的Vazyme公司。

在P. putida KT2440中构建DCA和2,4-D的生物降解途径

为了使单一菌株能够降解DCA和2,4-D，本研究采用已建立的基因编辑方法，将gfp、vgb基因以及DCA/2,4-D降解基因与表达调控元件整合到P. putida KT2440的基因组目标位置（见图S1），从而构建出工程菌株KTU-DDGV。图1展示了所构建的异源DCA和2,4-D降解途径与天然代谢途径的结合情况。

结论

本研究利用合成生物学底盘P. putida KT2440构建了工程菌株KTU-DDGV，该菌株能够将DCA和2,4-D矿化为CO₂。通过植入DCA和2,4-D的矿化途径、增强氧气捕获能力以及引入荧光追踪系统，实现了对实际废水系统中这些物质的实时监测。这种多功能工程菌株的应用有助于高效修复多种污染物。

CRediT作者贡献声明

Yujie Liu：撰写、审稿与编辑、软件应用、方法学设计、实验实施、数据分析、数据管理。 Xinyu Zhang：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、结果验证、软件应用、方法学设计、实验实施、数据分析、概念构建。 Haomin Chen：撰写、审稿与编辑、软件应用、方法学设计、实验实施、数据分析、数据管理。 Ziling Yuan：撰写、审稿与编辑、软件应用、方法学设计、实验实施、数据分析、数据管理。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中国国家重点研发计划（2024YFA0916500）、国家自然科学基金（52570205）以及深圳市自然科学基金（JCYJ20241202125905008）的支持。

CRediT作者贡献声明

XYZ和CY设计了本研究。XYZ、YJL、ZLY、HMC和DYM共同完成了实验工作。XYZ、YJL、ZLY、HMC、DYM、BZL、RHL和CY共同进行了数据分析。XYZ和CY共同撰写了论文。