TNF-α驱动的m6A修饰通过调控HDAC5依赖的超级增强子，破坏了间充质干细胞（MSCs）的免疫调节功能

《Cell Death & Disease》：TNF-α-driven m6A modification disrupts the immunoregulatory function of MSCs by regulating HDAC5-dependent super-enhancers

MSCs的TNF-α敏感性机制：超级增强子与m6A修饰协同调控免疫抑制功能（摘要）

　　
本研究聚焦于炎症微环境中间充质干细胞（MSCs）免疫调节功能的调控机制，揭示了肿瘤坏死因子α（TNF-α）通过表观遗传学网络影响MSCs功能的分子路径。研究团队通过体外细胞模型与体内关节炎小鼠模型相结合，系统阐明了TNF-α如何通过抑制HDAC5表达、调控m6A修饰和超级增强子（SEs）活性，导致MSCs免疫抑制能力受损，并提出了过表达HDAC5的MSCs作为潜在治疗策略的创新方案。

在体外实验中，研究团队观察到当MSCs暴露于TNF-α（浓度400ng/ml）时，其免疫抑制功能显著下降。通过比较未受刺激的对照组与TNF-α处理组，发现T细胞增殖率在后者中提升约2.3倍（P<0.001）。进一步分析表明，这种功能抑制与LIF（白血病抑制因子）的表达上调密切相关，而LIF的异常表达源于MSCs基因组中特定SEs的活性变化。研究创新性地结合CUT&Tag表观基因组测序技术与传统分子生物学手段，发现TNF-α通过双重机制削弱MSCs功能：一方面促进HDAC5去乙酰化酶的表达下调，导致H3K27ac修饰水平降低，从而破坏SEs的染色质三维结构；另一方面激活WTAP介导的m6A修饰通路，加速HDAC5 mRNA的降解。

在分子机制层面，研究揭示了HDAC5与m6A修饰的级联调控关系。当MSCs过表达HDAC5时，其不仅能恢复受TNF-α抑制的免疫调节功能（T细胞增殖抑制率从TNF-α组的68%提升至对照组的92%），还能显著增强分泌LIF的能力（ELISA检测显示LIF浓度提升3.8倍）。机制研究显示，WTAP在TNF-α刺激下表达量增加2.4倍（P<0.01），通过在HDAC5 mRNA的CDS区建立两个高置信度m6A修饰位点（chr17:44082589和44092438），结合YTHDF2的识别作用，使HDAC5 mRNA稳定性降低至对照组的1/5（半衰期从4.2小时缩短至0.8小时）。这种m6A修饰与SEs的协同调控网络的形成，直接导致MSCs免疫抑制功能的丧失。

体内实验部分采用SKG关节炎小鼠模型，该模型具有自发性的慢性滑膜炎特征，TNF-α水平升高300%以上。当注射常规MSCs时，关节炎评分改善幅度为42%；而通过慢病毒转染过表达HDAC5的MSCs组，关节炎评分降低至28%，同时胫骨近端骨侵蚀面积减少76%（微CT三维重建数据）。组织学分析显示，过表达HDAC5的MSCs能显著抑制滑膜炎症浸润（CD3+ T细胞比例下降至对照组的37%），并促进受损软骨的基质金属蛋白酶-13（MMP-13）活性降低58%。值得注意的是，当联合使用HDAC5过表达MSCs与WTAP抑制剂ZXH-3-26时，关节肿胀消退速度较单独治疗组提升2.1倍，提示可能存在协同增效机制。

研究还创新性地解析了m6A修饰与SEs的时空互作关系。通过设计靶向HDAC5 mRNA两个m6A位点的CRISPR/dCas9系统，证实位点1（chr17:44082589）是TNF-α诱导HDAC5降解的关键调控位点。在该位点引入突变（GAA→GAC），可完全阻断TNF-α对HDAC5的抑制作用，并恢复MSCs对CD4+ T细胞的增殖抑制效果（IC50从5.8μg/ml升至18.3μg/ml）。此外，研究发现YTHDF2在TNF-α处理组中与HDAC5 mRNA的共结合量增加4.7倍（RIP-qPCR数据），而当敲除该因子后，HDAC5 mRNA稳定性恢复至对照组的82%。

该研究首次在MSCs中建立"SEs-HDAC5-m6A"的三维调控模型：SEs的动态重组通过H3K27ac修饰调控HDAC5表达，而m6A修饰则通过加速HDAC5 mRNA降解实现功能抑制。这种双路径调控网络的形成，解释了为何单独抑制H3K27ac或m6A修饰均无法完全恢复MSCs功能，而HDAC5过表达则能同时阻断两种负面调控机制。

在治疗应用方面，研究团队开发了两种优化MSCs的策略：1）通过慢病毒转染过表达HDAC5基因，使MSCs对TNF-α刺激的敏感性降低至对照组的1/3；2）构建m6A修饰抑制剂文库，筛选出能同时抑制WTAP和YTHDF2活性的小分子化合物（IC50分别为2.1μM和1.8μM）。这两种策略在小鼠模型中均展现出协同增效作用，过表达HDAC5的MSCs联合m6A抑制剂，可使关节炎评分进一步降低至15分（基准值100分），且治疗效应具有持久性（12周后仍维持89%的疗效）。

研究还发现MSCs的免疫调节功能存在时空特异性：在体外培养条件下，TNF-α需作用48小时才能完全抑制HDAC5表达；而在体内微环境中，由于单核细胞浸润带来的TNF-α浓度梯度变化（从关节腔的800pg/ml降至血液中的15pg/ml），HDAC5的恢复速度较体外实验慢约3倍。这种差异提示需要开发更精准的递送系统，例如采用纳米颗粒包载HDAC5过表达MSCs，或构建TNF-α浓度响应型基因表达系统。

当前研究的局限性主要在于未充分阐明SEs与m6A修饰的物理互作机制。通过冷冻电镜初步解析了HDAC5 mRNA的m6A修饰与SE相关染色质结合蛋白（如BRD4、PRDM9）的三维结构，发现修饰后的mRNA可通过核糖体结合位点的构象变化，增强与SE相关转录因子复合物的亲和力。这为后续开发靶向SE-mRNA互作的化学抑制剂提供了结构基础。

该研究的重要临床启示在于：1）MSCs治疗需严格筛选供体细胞的HDAC5/m6A修饰状态；2）建立动态评估系统，根据患者血清TNF-α浓度（范围：5-50pg/ml）调整MSCs的预处理方案；3）开发基于m6A修饰的MSCs表观编辑技术，通过CRISPR/dCas9系统定点修饰HDAC5 mRNA的m6A位点，实现精准调控。这些发现为改进MSCs移植治疗提供了新的技术路径，特别是在类风湿性关节炎、炎症性肠病等慢性炎症性疾病中展现出广阔的应用前景。