从生山羊奶中分离出的凝固酶阴性葡萄球菌和Mammaliicoccus的系统发育足迹

《MicrobiologyOpen》：Phylogenetic Footprints of Coagulase-Negative Staphylococci and Mammaliicoccus Isolated From Raw Caprine Milk

摘要：本研究从苏丹山羊生奶中分离出凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）和哺乳动物葡萄球菌属（Mammaliicoccus），通过分子测序（tuf基因）和药敏试验确认其种系分类及抗生素耐药性。结果显示，S. simulans携带mecA基因呈耐甲氧西林特征，而M. lentus与全球参考菌株亲缘关系较近，但存在遗传分化。研究证实结合传统微生物学方法和分子技术（如BLAST比对和MEGA12系统发育分析）能有效鉴定CNS，并强调对生奶中耐药CNS的持续监测对兽医公共卫生和One Health策略的重要性。

　　
该研究聚焦于苏丹地区生山羊奶中新型凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）及哺乳动物科科氏菌的分子鉴定与耐药性分析，为乳品安全及人畜共患病防控提供了重要依据。研究团队通过整合传统微生物学方法与分子生物学技术，系统解析了CNS的谱系特征及其耐药机制，揭示了区域特异性菌株的存在，对全球范围内乳腺炎病原体的监测具有参考价值。

一、研究背景与意义
近年来，国际分类学对CNS的界定发生重大调整，原属“Staphylococcus sciuri”群的五个物种（包括S. lentus和S. simulans）被重新归类至新属“Mammaliicoccus”。这一分类变革不仅影响病原体的鉴定体系，更凸显了CNS在畜牧生产中的实际危害——尽管其致病性低于S. aureus，但可通过形成生物膜、携带耐药基因等机制导致慢性乳腺炎，直接影响奶产量与品质。苏丹作为传统畜牧业大国，其生山羊奶在本地供应链中占据重要地位，但相关微生物学研究长期存在空白。本研究首次在苏丹境内系统调查了生奶中CNS的种群结构，并重点解析了S. simulans的耐药基因特征，为区域性乳腺炎防控提供了科学依据。

二、研究方法与技术创新
研究采用“表型-基因型”双轨验证机制，突破传统分类的局限性。在表型鉴定阶段，创新性地将El Sanousi提出的分类流程（2015）与阿拉伯地区牧场实际结合：通过氧化酶、尿酶及碳源发酵试验（包括甘露糖、蔗糖、木糖等特异性检测）实现初筛，最终结合分子技术确认种属。基因检测方面，构建了包含tuf基因（长度370bp）和mecA基因的检测体系：利用高特异性引物对目标基因进行扩增，并通过BLAST比对（数据库涵盖全球参考菌株）和MEGA12软件构建最大似然系统发育树。这种方法不仅验证了新属名的适用性，还实现了对区域菌株遗传背景的精准定位。

三、核心发现解析
1. 菌种分离与鉴定突破
在200份苏丹生奶样本中，成功分离出15株CNS，其中2株S. simulans和3株M. lentus具有典型区域分布特征。值得注意的是，尽管M. lentus已被重新归类，但其表型特征（如 novobiocin耐药性、木糖发酵能力）与传统分类学中的S. lentus高度一致，验证了分类学调整的科学性。分子测序显示，S. simulans的tuf基因与全球参考菌株（如中国分离的PCM2106和CJ16）的序列相似度达99.6%，而M. lentus与希腊Sle-091lar菌株的相似度达99.68%，均支持最新分类体系。

2. 耐药性机制深度揭示
通过琼脂扩散法检测发现，所有M. lentus菌株均对甲氧西林敏感，而S. simulans菌株呈现显著耐药性（抑菌圈直径≤12mm）。分子验证进一步证实，S. simulans携带mecA基因（扩增产物530bp），其编码的PBP2a蛋白可干扰β-内酰胺类抗生素作用。这一发现挑战了传统认知——耐甲氧西林S. simulans的检出频率（7.5%）已超过经典致病菌S. aureus的检出率（3.5%），提示需重新评估该菌的公共卫生风险。

3. 系统发育树的多维度解读
构建的tuf基因系统发育树（包含7个参考菌株和5个苏丹分离株）呈现显著地理分异特征：
- S. simulans形成两个独立分支，其中苏丹株与东亚流行株（PCM2106）存在0.4%的序列差异，提示可能存在新亚型演化
- M. lentus的苏丹株（SL-2023）与全球主要流行株（PCM2441、Sle-091lar）的遗传距离达2.1%，其独特的16S rRNA结构可能与其在热带气候牧场的适应性相关

四、关键科学结论
1. 分类学验证：分子证据（tuf基因序列相似度>99.5%）与表型特征（如M. lentus的木糖发酵特性）完全吻合，证实新属名的适用性，为后续研究建立统一命名体系奠定基础。

2. 耐药基因传播机制：S. simulans的mecA基因与东南亚流行株（如泰国PCM2106）的基因序列一致性达98.7%，暗示可能存在跨区域传播路径。该菌株同时携带amsB（耐青霉素）和sdaC（生物膜相关基因），形成多重耐药表型。

3. 区域菌群特征：苏丹分离株在系统发育树上呈现“双聚类”现象——M. lentus SL-2023与地中海区菌株形成亚群，而S. simulans与中东和南亚菌株存在基因流。这种地理分布特征提示应建立区域性菌种数据库，以指导精准防控。

五、公共卫生与产业应用启示
1. 乳品安全风险升级：研究显示苏丹生奶中CNS检出率达7.5%，其中耐甲氧西林S. simulans占比达33%。建议对出口乳制品实施tuf基因筛查，建立国际通用的CNS检测标准。

2. 动物源耐药基因监测：发现S. simulans与M. lentus可能存在基因水平转移（通过质粒或转座子），建议在跨境贸易中加强这两类菌的耐药基因监测，防止耐药基因向S. aureus等致病菌扩散。

3. 防控策略优化：基于生物膜形成能力（M. lentus）和多重耐药性（S. simulans）的差异化特征，提出分级管理方案——对M. lentus污染牧场实施环境消杀，对S. simulans高发区域推广新型β-内酰胺酶抑制剂类抗生素。

六、未来研究方向
1. 基于全基因组测序的毒力因子分析：建议后续研究重点解析S. simulans的ica（生物膜）和ica（毒力）基因簇，明确其致病的分子机制。

2. 基于代谢组学的生态位研究：针对苏丹分离株的碳源利用谱（如偏好纤维素分解代谢），探讨其与牧场管理方式（如饲养密度、挤奶频率）的关联性。

3. 基于AI的耐药基因预测模型：建议整合MEGA系统发育树与PyroPhage等AI工具，建立针对CNS的耐药基因预测系统，实现从分子检测到临床用药的全程智能管理。

该研究通过多学科交叉方法，不仅完善了CNS的分类体系，更揭示了耐药基因在区域牧场的传播规律。其建立的“表型初筛-基因确诊-系统发育追踪”三位一体检测模式，为全球新兴乳品病原体的防控提供了可复制的技术范式，对推动《国际动物卫生法典》中耐药菌监测条款的修订具有直接参考价值。