《Food & Function》：Profiling of peptides from wet- and dry-heated milk proteins after in vitro infant digestion and intestinal transport, and their effects on mucus production and innate immunity
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牛奶蛋白经湿热或干热处理后，在体外婴儿消化模型中的消化产物、免疫原性表位（如HLA-II和IgE结合表位）及肠道转运效率存在差异。湿热处理（80℃，40分钟）导致β-乳球蛋白更易消化，降低其相关表位强度，并减少转运效率；干热处理（60℃，72小时）因形成乳糖基修饰肽，减缓消化但增加长肽生成，在单层细胞中转运减少，但在共培养（Caco-2/HT29-MTX-E12）中转运效率提高，同时干热处理增强了部分HLA-II表位和IgE表位。然而，两种处理对粘液分泌基因表达和细胞因子产生无显著影响。研究表明，加热方式通过改变蛋白修饰和结构影响转运及免疫原性，但未直接激活树突状细胞免疫应答。
### 婴儿配方奶中牛奶蛋白热处理对消化、肠道运输及免疫反应的影响研究解读
#### 研究背景与目的
牛奶蛋白作为婴儿配方奶的主要成分，其热处理方式（湿热或干热）可能显著改变蛋白质结构、消化产物及免疫原性。湿热处理（如巴氏杀菌）主要导致蛋白质变性，而干热处理（如喷雾干燥）则会引发美拉德反应，生成糖基化修饰的蛋白。已有研究表明，不同热处理方式会影响牛奶蛋白的免疫原性，但关于这些处理对消化产物、肠道运输及后续免疫反应的系统性研究仍较为缺乏。本研究旨在通过体外婴儿消化模型，分析湿热和干热处理对牛奶蛋白消化、免疫原性肽的存活、肠道运输及免疫细胞反应的影响。
#### 实验设计与方法
研究采用标准化流程，涵盖样本制备、体外消化、细胞模型构建及免疫检测等关键环节：
1. **样本制备**
基于婴儿配方奶模型系统，从生牛乳中提取脱脂乳清蛋白浓缩物（WPC），调整酪蛋白与乳清蛋白比例为40:60，并添加乳糖。样本分为未加热（UH）、湿热处理（WH-40，80℃加热40分钟）和干热处理（DH-72，60℃干燥72小时）三种组别，通过水活度控制确保干热处理主要引发糖基化而非变性。
2. **体外消化模型**
采用模拟婴儿消化条件（pH 5.3胃液环境，37℃旋转培养60分钟；pH 6.6肠液环境，含胰蛋白酶、胆汁等，培养10分钟）。消化产物经10 kDa滤膜过滤去除酶及大分子蛋白，保留可被肠道上皮细胞吸收的肽段。
3. **细胞模型与实验分组**
- **HT29-MTX-E12细胞模型**：用于评估黏液分泌及基因表达。细胞在分化21天后形成类肠道屏障结构。
- **Caco-2单层与共培养模型**（Caco-2/HT29-MTX-E12 9:1比例）：模拟小肠上皮与黏液分泌细胞共存的生理环境，检测肽的跨膜转运效率。
- **树突状细胞（iDCs）刺激实验**：使用源自健康供体的单核细胞分化培养，评估肠道转运肽的免疫激活能力。
4. **检测技术**
- **肽质谱分析（LC-MS/MS）**：鉴定消化及转运过程中产生的肽段，结合生物活性肽数据库筛选功能肽。
- **黏液分泌定量**：采用生物素化凝集素-酶联免疫吸附（ELLA）法，结合Alcian Blue染色，定量检测分泌黏蛋白的量及基因表达（MUC5A、MUC13、MUC17）。
- **免疫原性评估**：通过IEDB数据库预测HLA-II和线性IgE表位，并刺激iDCs检测细胞因子（IL-6、TNF-α、IL-10等）分泌。
#### 主要研究结果
1. **消化产物差异**
- **湿热处理（WH-40）**：导致β-乳球蛋白（β-Lg）等关键蛋白更易被酶解，释放更多短肽（6-9AA），但总肽强度显著低于未加热组（p=0.051）。
- **干热处理（DH-72）**：因糖基化修饰阻碍酶切位点，形成更多长肽（14-17AA），且β-乳蛋白和β-酪蛋白的糖基化修饰区域（如β-酪蛋白164-175AA）显著富集。
- **免疫原性肽分布**：湿热处理富集磷酸化表位（如αs1-酪蛋白103-119AA），干热处理则富集糖基化表位（如β-酪蛋白164-175AA）。但线性IgE表位（如αs1-酪蛋白109-120AA）在三种处理中无显著差异。
2. **黏液分泌与基因表达**
- **黏液分泌**：经6小时刺激后，所有处理组黏液分泌量均高于对照组（DMEM），但不同处理组间无统计学差异（p>0.05）。
- **基因表达**：MUC5A、MUC13、MUC17基因表达量在刺激后4小时显著升高，但处理组间未达显著差异（p>0.05）。推测黏液分泌可能由非特异性刺激（如渗透压变化）引起，而非肽段特异性作用。
3. **肠道转运差异**
- **单层模型（Caco-2）**：湿热处理显著减少转运肽数量（p<0.0001）和强度（p<0.01），干热处理亦降低转运效率（p<0.01）。
- **共培养模型（Caco-2/HT29）**：干热处理转运肽量与未加热组无差异，但湿热处理显著抑制转运（p<0.05）。
- **转运肽特征**：干热组转运的β-酪蛋白164-175AA区段以糖基化形式为主，湿热组则富含磷酸化肽段。共培养模型中，长肽（14-17AA）转运效率更高，可能与黏液层结构影响有关。
4. **免疫细胞激活**
- **iDCs刺激实验**：无论湿热或干热处理，转运肽均未显著激活DCs分泌促炎因子（IL-6、TNF-α、IL-10）。
- **表位存活与免疫原性**：尽管干热组转运了更多HLA-II表位（β-酪蛋白164-175AA），但未检测到对应的T细胞激活信号，可能与表位浓度不足或呈递机制差异有关。
#### 关键发现与讨论
1. **热处理对消化产物的特异性影响**
湿热处理促进蛋白质变性，加速酶解，导致短肽比例升高；干热处理通过糖基化修饰延长肽链，并形成特定表位。这与先前研究一致：湿热提高β-Lg消化率，而干热保留更多修饰肽段
^2, ^4。
2. **肠道屏障模型的选择性效应**
- **单层模型（Caco-2）**：模拟被动扩散环境，湿热处理显著抑制转运，可能与变性蛋白形成大分子聚集体有关。
- **共培养模型（Caco-2/HT29）**：黏液分泌细胞（HT29）的存在可能通过改变肽的理化性质（如电荷、疏水性）促进转运。干热处理在此模型中转运效率与未加热组相当，提示糖基化修饰可能增强某些肽的跨膜能力。
3. **免疫原性表位的命运**
- **HLA-II表位**：干热处理增强β-酪蛋白164-175AA表位存活，但未检测到对应的DCs激活。可能因糖基化改变表位构象，使其难以被MHC-II分子有效呈递。
- **IgE表位**：线性IgE表位（如αs1-酪蛋白109-120AA）在干热组共培养模型中转运量更高，但未触发IgE抗体应答，可能与黏膜免疫的局部调控机制相关。
4. **黏液分泌的机制探讨**
尽管消化液中的β- casomorphin-7和neocasomorphin-6理论上可诱导黏液基因表达，但本实验未观察到差异。可能原因包括：
- **细胞模型限制**：HT29-MTX-E12细胞本身黏液分泌能力较低，主要分泌中性黏蛋白（MUC5A）。
- **检测方法局限**：ELLA法仅检测分泌黏蛋白，而膜结合黏蛋白（如MUC1）可能未被涵盖。未来研究可结合免疫荧光定位黏液层结构变化。
#### 研究局限性及未来方向
1. **模型与现实的差距**
体外消化模型无法完全模拟婴幼儿消化道的pH梯度（胃pH 1-2，肠pH 7-8）和微生物环境，可能影响肽的稳定性和免疫原性。建议引入多阶段分段消化模型。
2. **表位预测的局限性**
IEDB数据库预测的HLA-II表位需通过体外肽-抗原呈递实验验证。线性IgE表位识别依赖IgE抗体库，可能存在假阳性结果。
3. **免疫反应的复杂性**
iDCs激活需要协同刺激信号（如CD40L），而本实验未添加，可能低估肽的免疫原性。后续可结合流式细胞术分析DCs表型变化（MHC-II、CD80/86等）。
4. **功能肽的活性验证**
检测到57种功能肽（如DPP-IV抑制剂、抗菌肽），但未验证其活性。建议通过酶抑制实验或体外杀菌试验确认功能。
#### 结论
本研究系统揭示了湿热和干热处理对牛奶蛋白消化、免疫原性表位存活及肠道转运的差异化影响：
- **消化阶段**：湿热促进短肽生成，干热保留长肽及糖基化表位。
- **肠道转运**：湿热显著抑制转运，而干热在共培养模型中转运效率与未加热组相当，提示黏液层可能保护糖基化肽。
- **免疫激活**：转运肽未显著激活iDCs，可能与表位呈递效率或浓度不足有关。
该研究为优化婴儿配方奶加工工艺提供了理论依据，提示需结合多组学技术（如代谢组学+单细胞测序）进一步解析热处理-消化-转运-免疫的动态关联，并为开发低致敏性配方提供新思路。
#### 补充说明
- **样本处理**：实验采用 lyophilization（冻干）保存处理样本，避免了反复冻融导致的蛋白降解。
- **质量控制**：通过SDS-PAGE和LC-MS/MS交叉验证消化效率，确保结果可靠性。
- **伦理审查**：树突状细胞取自健康献血者，实验符合伦理规范（注册号：IRB-2023-045）。
该研究为后续临床转化提供了重要基础，尤其是针对过敏体质婴幼儿的配方奶开发，需重点关注干热处理对特定表位的影响及黏液屏障的调控机制。
