中国葡萄病毒L的遗传变异及其检测方法的开发（RT-qPCR检测技术）

《Journal of Plant Pathology》：Genetic variability of grapevine virus L in China and development of RT-qPCR assay for its detection

葡萄卷叶病毒L（GVL）检测方法开发及基因组分析：基于12个中国分离株的RT-qPCR技术建立，灵敏度较传统RT-PCR提升100倍，检测率在实验室保存株中达87%，田间样本中检测率15%。通过ORFs和全基因组序列的系统发育分析，确认分离株分属2个已知谱系。

　　

摘要

葡萄病毒L（GVL）是一种新发现的感染葡萄植株的病毒。在本研究中，从中国分离出了12株GVL病毒株，并对其进行了系统发育分析。基于这些研究结果，开发出了一种高效且快速的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）检测方法。通过对国家落叶果树病毒消除中心保存的221份葡萄样本进行RT-qPCR检测，发现其中5.4%的样本受到GVL病毒感染。通过RT-qPCR和克隆技术获得了这12株GVL病毒株的完整基因组序列。这些GVL病毒株之间的核苷酸同源性在73.7%到99.3%之间，与NCBI数据库中已发表的GVL病毒株的同源性在72.6%到99.4%之间。基于不同开放阅读框（ORFs）和完整基因组序列的系统发育分析，将这些病毒株分为已知的五个谱系组中的两个组。所建立的RT-qPCR检测方法能够准确识别出属于这两个变异组的GVL病毒株，其检测结果具有很强的线性相关性（R2=0.998），并且在标准曲线上的扩增效率很高（E=99.0%）。该方法比传统的RT-PCR灵敏度高100倍，能够特异性地检测出GVL病毒。组内和组间的重复性测试验证了该检测方法的可靠性和一致性。RT-qPCR可以用于检测多种类型的葡萄样本。在来自不同季节和保存地点的193份样本中，RT-qPCR的检测率为87%，高于传统RT-PCR的70.9%。此外，对辽宁省不同地区的15个品种的60份田间葡萄样本进行检测时，传统RT-PCR的检测率为13.3%，而RT-qPCR的检测率为15%，并在3个葡萄品种中检测到了GVL病毒。