保护乳铁蛋白以实现铁的输送：基质组成和铁含量对乳铁蛋白胃部稳定性的影响

《Food Hydrocolloids》：Protecting lactoferrin for iron delivery: Effects of matrix composition and iron loading on gastric stability

口服铁盐存在吸收差和胃肠道副作用问题，本研究通过形成LF与稳定剂（羧甲基钠caseinate、低甲氧基果胶、乳清蛋白水解物）的复合物，评估了不同铁负载和稳定剂组合对LF胃稳定性的影响。结果表明高铁负载ternary complexes（如TC_H、TP_H）在胃中稳定性最佳，而binary complexes（如BC、BP）稳定性较低。肠道阶段，高铁ternary complexes释放更多铁结合肽，可能提高铁生物利用度。

　　
该研究聚焦于乳铁蛋白（Lactoferrin, LF）的稳定化改造及其在胃肠消化中的性能评估，旨在开发更高效且耐受性更好的铁补充剂。乳铁蛋白作为一种天然铁载体，凭借其铁结合能力、免疫调节特性及抗炎功能，被广泛视为理想的铁补充形式。然而，其天然结构易在胃酸和消化酶作用下降解，导致铁释放效率低下。为此，研究者通过构建不同稳定化复合物（涉及琥珀酸化酪蛋白、低甲氧基果胶及乳清蛋白水解物），系统评估了铁负载与稳定化配体协同作用对LF稳定性的影响，并解析了消化过程中的结构变化与生物活性肽释放规律。

### 关键发现与机制解析
1. **稳定化复合物的构建与分类**
研究设计了三种稳定化策略：
- **二聚体（BC/BP/BW）**：LF与稳定化配体（如琥珀酸化酪蛋白SC）直接结合，未额外添加铁。
- **三聚体（TC/TP/TW）**：在二聚体基础上引入铁源（硫酸亚铁），形成LF-配体-铁复合物。其中，铁饱和度通过配体与LF的比例调控，例如TC_H（高铁负载）的LF:SC:Fe摩尔比为1:2:3，而TW_H的LF:WPH:Fe比为1:2:1。
- **对照组**：包括未稳定化的天然牛乳铁蛋白（nb）、重组牛乳铁蛋白（rb）及铁饱和的重组人乳铁蛋白（rh-Fe）。

2. **胃相中的稳定性差异**
通过模拟胃液（pH 3.0）消化实验发现：
- **未稳定化LF（nb/nb-Fe）**：5分钟胃消化即出现严重降解，至120分钟几乎完全分解为短肽（≤12氨基酸）。铁饱和（nb-Fe）仅短暂延缓降解，但无法阻止最终分解。
- **重组LF（rb/rh）**：稳定性显著优于天然LF。rb在胃消化120分钟后仍保留部分完整蛋白，而rh/rh-Fe在胃消化中表现更稳定，但至肠相（pH 7.0）时仍完全降解。
- **稳定化复合物**：
- **SC/果胶复合物**：三聚体（TC_H/TP_H）在胃消化120分钟时保留约60%完整LF蛋白，二聚体（BC/BP）因未结合铁而稳定性较差，但在添加外源铁（BC-Fe/BP-Fe）后，其稳定性接近三聚体。
- **WPH复合物**：无论二聚体（BW）还是三聚体（TW_H）均无法抵抗胃酸作用，120分钟时完全降解。
- **机制推测**：SC与果胶的静电/疏水作用及三维网络结构能有效屏蔽胃蛋白酶攻击，而WPH的短肽链特性使其更易被水解。

3. **肠相中的铁释放与生物活性肽生成**
胃相稳定后的样品进入肠液（pH 7.0，含胆盐及胰酶）进一步消化，结果显示：
- **铁结合肽释放**：高铁负载三聚体（TC_H/TP_H）在肠相10分钟时释放的铁结合肽（如His272、Tyr545等位点相关肽段）浓度最高，表明铁饱和可能通过稳定LF构象延缓铁释放，使其在肠黏膜吸收阶段逐步释放。
- **生物活性肽变化**：
- **抗菌肽TRVVWCAVG**：在胃相中优先释放，其生成量与LF稳定性呈负相关（如TC_H胃相释放最少，肠相铁结合肽最多）。
- **骨生成肽FKSETKNLL**：持续在胃相中释放，稳定化复合物（尤其TC_H）在肠相仍能检测到该肽，提示其生物活性可能通过缓慢释放发挥作用。
- **重组与人源LF的差异**：rh系列在胃相中稳定性优于天然LF，但肠相中完全降解，表明人源LF的天然构象可能更适于胃酸环境，但肠吸收效率仍需优化。

4. **稳定化机制的多维度分析**
- **SDS-PAGE证据**：稳定化复合物在胃相120分钟仍保留明显完整LF条带（分子量约66 kDa），而未稳定化样品（nb）仅见分解产物。
- **LC-MS/MS谱学分析**：
- **肽长分布**：稳定化复合物在胃相中以短肽（7-20氨基酸）为主（<5%长肽），而未稳定化LF（nb）在胃相5分钟即出现大量20-32氨基酸的长肽。
- **氨基酸覆盖**：稳定化复合物因部分肽段被包裹而氨基酸覆盖度降低（如TC_H仅覆盖73%序列），但关键铁结合位点（N/C lobes）的肽段保留完整。
- **聚类分析**：胃相120分钟时，TC_H、BC-Fe与TP_H形成稳定簇，表明SC与果胶的协同保护作用优于单一配体；而TW_H与未稳定化样品（nb）因降解速率相近被归为低稳定性组。

### 临床应用潜力与挑战
1. **最佳稳定化方案**：
- **高铁三聚体（TC_H/TP_H）**：兼具胃相稳定性（>80%完整LF）和肠相高效铁释放（肠相10分钟释放铁结合肽量达BC-Fe的2倍）。
- **铁负载二聚体（BC-Fe/BP-Fe）**：通过外源铁增强LF稳定性，但需平衡成本与铁含量（如BC-Fe铁负载达40.9 mg Fe/g LF）。

2. **铁释放动力学优化**：
研究发现，铁饱和可能通过维持LF的“闭合构象”（holoferrin）抑制胃酸诱导的构象展开，从而延缓铁释放。但肠相中稳定化复合物（如TC_H）的铁结合肽释放速率仍低于天然LF（nb-Fe），提示需进一步优化铁-蛋白-配体比例。

3. **重组与人源LF的适用性**：
重组LF（rb/rh）虽在胃相中稳定，但缺乏天然LF的受体介导吸收特性（Suzuki et al., 2005）。因此，天然LF的稳定化改造更具临床价值，尤其是对孕妇和儿童等敏感人群。

### 未来研究方向
1. **铁释放效率与生物利用度关联性研究**：需通过体外模拟肠黏膜吸收（如Caco-2细胞模型）量化铁释放动力学与肠道吸收效率的关系。
2. **长期稳定性验证**：当前实验仅模拟单次消化过程，未来需评估复合物在胃内滞留时间延长后的稳定性（如空腹与餐后服用差异）。
3. **多组分协同效应**：探索果胶与酪蛋白的复配（如SC-LMP-WPH四聚体）对LF稳定性的增强作用。
4. **铁生物价评估**：现有研究未检测铁释放效率，需结合化学法（如邻菲啰啉法）与生物学法（如细胞铁摄取实验）综合评价。

### 结论
该研究证实，通过铁负载与稳定化配体（SC/LMP）的协同作用，可显著提升LF在胃相中的稳定性，并在肠相实现可控的铁结合肽释放。其中，高铁三聚体（TC_H/TP_H）和铁负载二聚体（BC-Fe/BP-Fe）为候选产品，但需进一步验证其临床转化潜力，包括铁生物价、免疫调节协同效应及长期安全性。研究为开发基于乳铁蛋白的智能型铁补充剂提供了理论依据，尤其在预防妊娠期和儿童期缺铁性贫血方面具有应用前景。