《Food Control》：Effect of heat-resistant protease from psychrotrophic bacteria in raw milk on shelf-life quality of UHT milk
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UHT牛奶中耐热蛋白酶活性影响品质研究：通过添加Aeromonas sp.蛋白酶于不同浓度及储存温度（4、25、37℃），发现酶浓度≥0.08 U/mL时在37℃下28天即出现乳清分离、pH下降、酪蛋白水解等变质现象，且温度越高变质越快。4℃储存时98天未显著变质。证实κ-酪蛋白是主要水解目标，揭示酶活性阈值与储存条件对保质期的影响机制。
Jinyu Xu|Xue Hei|Mumin Zheng|Yunna Wang|Ning Xie|Xu Li|Xiaodan Wang|Jiaping Lv|Gang Lu|Xiaoyang Pang|Dongwei Yu|Shuwen Zhang
中国农业科学院食品科学技术研究所，北京，100193，中国
摘要
超高温度（UHT）牛奶在保质期内的质量恶化，如蛋白质水解，与来自嗜冷细菌的热稳定蛋白酶的残留活性密切相关。本研究旨在评估来自嗜冷细菌的热稳定蛋白酶活性对全脂牛奶质量的影响。将不同浓度的来自Aeromonas sp的热稳定蛋白酶添加到UHT牛奶中，并在不同温度下储存期间研究其对牛奶质量的影响。结果表明，随着保质期的延长，所有样品的pH值、稳定性和荧光强度逐渐下降，而水解程度、平均粒径、沉淀物和Zeta电位显著增加。SDS-PAGE的结果表明，κ-酪蛋白被蛋白酶优先水解。此外，UHT牛奶的恶化程度与蛋白酶的浓度相关。当牛奶中的蛋白酶浓度达到0.08 U/mL时，在37°C下储存28天后样品达到保质期结束，而在4°C下储存98天后未观察到显著恶化。本研究的结果为控制UHT牛奶在储存期间的质量并延长其保质期提供了有价值的证据。
引言
超高温度（UHT）处理是一种快速且高效的杀菌方法，广泛用于提高原奶的安全性并延长其保质期（Deng等人，2019年）。UHT牛奶可以在室温下运输和储存，其在全球市场的消费量稳步增长（Aguilera-Toro等人，2023年）。UHT处理可以灭活原奶中的大多数嗜冷细菌（Baglinière等人，2017年）。然而，在UHT处理之前的冷链运输过程中，嗜冷细菌会继续向牛奶中分泌热稳定的胞外蛋白酶。这些热稳定酶不能被高温完全灭活，残留的酶可能导致严重的质量问题，包括营养成分降低、味道苦涩或变质，从而影响牛奶在保质期内的质量（Matéos等人，2015年）。
从原奶中常见的嗜冷细菌包括Pseudomonas、Acinetobacter、Bacillus、Aeromonas（Yuan等人，2017年）。研究表明，UHT牛奶中嗜冷细菌的残留蛋白酶活性在储存期间会持续对产品质量产生负面影响。Qin等人（2023年）发现，被Pseudomonas fluorescens污染的UHT牛奶在25°C下储存11周后出现乳清分离现象，稳定性随时间下降。这表明UHT牛奶的质量会随着储存时间的延长而恶化。根据Anema（2022年）的研究，牛奶中的老化凝胶形成是由于κ-酪蛋白的水解，导致酪蛋白胶束沉淀。结果，这些胶束沉积在包装底部，逐渐浓缩并聚集成凝胶层。研究表明，蛋白酶通过改变酪蛋白胶束的物理化学特性来降低牛奶的稳定性（Baglinière等人，2013年）。同样，据报道Bacillus spp.和Acinetobacter spp.产生的热稳定蛋白酶在热处理后仍然具有活性，并影响牛奶的稳定性（Qin等人，2023年；Yang等人，2021年）。Yuan等人（2018年）报道了Aeromonas的腐败潜力。然而，与关于Pseudomonas蛋白酶对牛奶影响的大量研究相比，关于Aeromonas的研究仍然有限。尽管嗜冷细菌分泌的热稳定蛋白酶已成为乳制品生产中的一个热点话题，但导致牛奶恶化（表现为凝胶化和沉淀）的蛋白酶活性阈值仍不清楚。因此，迫切需要采取有效措施来控制对UHT牛奶质量的不良影响。
在这项工作中，我们专注于从原奶中分离出的一种Aeromonas菌株，该菌株在初步筛选中表现出显著高的胞外蛋白酶活性。通过添加不同浓度的嗜冷细菌热稳定蛋白酶，加速了UHT牛奶的恶化过程。在不同储存条件（4°C、25°C和37°C）下监测了样品的保质期。我们系统地评估了蛋白酶对UHT牛奶质量的影响，包括pH值、蛋白质水解、荧光强度和稳定性。本研究旨在探讨不同蛋白酶浓度和储存温度对保质期的影响，从而确定导致产品恶化的蛋白酶活性阈值。这些结果不仅为评估和控制嗜冷细菌残留蛋白酶活性对UHT牛奶的影响提供了科学依据，还为延长产品保质期和提高牛奶质量提供了有价值的见解。
材料
硫酸铵、氯化钙（CaCl2）和醋酸钠购自中国北京的中药化学试剂有限公司。Azocasein购自中国上海的源业生物技术有限公司。邻苯二甲醛（OPA）和β-巯基乙醇购自中国上海的Aladdin公司。2 × Laemmli样品缓冲液购自美国加州的Bio-Rad公司。
蛋白酶和牛奶样品的制备
Aeromonas sp.的分离：Aeromonas sp.的分离按照Dai等人（2023年）的描述进行。
具有不同浓度蛋白酶的牛奶保质期的测定
图1显示了在不同温度和蛋白酶浓度下样品在98天内的保质期变化。在25°C下，含有27.38 U蛋白酶的UHT牛奶在70天后出现乳清和牛奶之间的明显分离。在37°C下，含有20.36 U、22.31 U和27.38 U蛋白酶的牛奶样品在28天后也出现了乳清和牛奶之间的明显分离。在56天时，含有15.19 U蛋白酶的牛奶样品也出现了同样的现象，这可能与
结论
嗜冷细菌残留的热稳定蛋白酶仍然是乳制品行业面临的一个重大挑战。本研究探讨了不同蛋白酶水平和储存温度对牛奶保质期的影响。结果表明，较高的蛋白酶浓度和储存温度会导致储存期间更早出现质量问题，如蛋白质水解、沉淀和稳定性下降。κ-酪蛋白被水解
CRediT作者贡献声明
Jinyu Xu：撰写——原始草案、软件、方法学、数据分析。Xue Hei：撰写——审稿与编辑、软件、方法学、数据分析。Mumin Zheng：撰写——审稿与编辑、方法学、资金获取。Yunna Wang：数据可视化、数据分析。Ning Xie：数据可视化、数据分析。Xu Li：数据可视化、数据分析。Xiaodan Wang：数据可视化、数据分析。Jiaping Lv：监督、方法学、概念构思。Gang Lu：数据可视化，
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
中央地方科技发展基金（2024ZY0037, YDZX2024111）；云南科技计划（202402AE090033）；上海乳品应用技术研发计划（授权号2023）；中国农业研究系统-国家乳业技术系统（CARS-36）；石家庄农业技术计划（编号24031）；中国农业科学院食品科学技术研究所农业科技创新计划
