来自乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）的一种食品级抗菌肽：这是一种高效且稳定的生物防腐剂，能够有效抵御橙汁中的革兰氏阴性病原体

《Food Control》：A food-grade antimicrobial peptide from Lactococcus lactis: A potent and stable bio-preservative against Gram-negative pathogens in orange juice

抗菌肽SH在重组乳酸乳球菌中的合成及其在橙汁保鲜中的应用显示其高效广谱抑菌、低毒性和极端条件稳定性，为天然食品防腐剂开发提供新策略。

　　

Mingyang Hu|Sina Cha|Yuwen Li|Lu Zhao|Yutong Xue|Chenyu Xue|Na Dong|Anshan Shan

中国黑龙江省哈尔滨市东北农业大学动物科学与技术学院分子营养与免疫实验室

摘要

食品工业中广泛使用化学防腐剂引发了人们对潜在健康风险和细菌耐药性出现的担忧，从而推动了对天然替代品的需求。本文报道了在Lactococcus lactis中通过NaCl诱导产生的一种新型抗菌肽（SH）的食品级生物合成方法。经过优化表达和纯化后，SH对Escherichia coli和Salmonella等革兰氏阴性病原体表现出强烈的抗菌活性，同时对哺乳动物细胞和益生菌细胞无毒性。此外，SH在极端温度、宽pH范围和高NaCl条件下仍具有优异的稳定性。机制研究表明，SH能够结合脂多糖，破坏细菌膜，诱导活性氧的产生，抑制脱氢酶活性，并与DNA相互作用。当应用于橙汁时，SH显著减少了微生物数量并减缓了维生素C的降解。这些结果表明SH是一种安全、稳定且有效的生物防腐剂，具有提升食品安全的巨大潜力。

引言

食品工业中化学防腐剂的广泛使用长期以来被认为是控制微生物腐败的有效手段。然而，人们对它们潜在的毒性、致癌性和致畸性以及细菌耐药性问题的日益关注，引发了重大的公共卫生和食品安全问题（Warner, 2024）。与此同时，全球向清洁标签和天然食品产品的转变加剧了寻找合成防腐剂安全可持续替代品的努力，使天然抗菌剂成为食品科学研究的前沿（Choi et al., 2024; Shi et al., 2024b）。

在这些替代品中，抗菌肽（AMPs）引起了广泛的科学兴趣。它们具有广谱抗菌活性、独特的膜破坏机制，能够抑制耐药性的产生，并且具有良好的生物相容性，使其成为食品防腐的理想候选者（H. Li et al., 2022b; Sugrue et al., 2024; Zhu et al., 2025）。事实上，由乳酸菌（LAB）产生的细菌素如nisin和Pediocin PA-1/AcH已经作为生物防腐剂取得了显著的商业成功（Bisht et al., 2024）。然而，天然AMPs的广泛应用受到一些内在缺陷的限制，包括天然产量低、生产成本高以及对于极端pH值、蛋白水解和高盐浓度等加工条件的敏感性（Oliveira Júnior et al., 2025; Xue et al., 2024）。例如，Pediocin PA-1/AcH对Listeria monocytogenes具有高效且特异的抑制作用，这限制了其在多种食品基质中的应用（Kuniyoshi et al., 2022）。

为了解决这些限制，重组DNA技术为高效且经济地生产AMPs提供了有力手段（Nazarian-Firouzabadi et al., 2024）。Lactococcus lactis作为一种公认安全（GRAS）的微生物，是表达用于食品应用的重组蛋白的理想平台（Ullah et al., 2025; Xie et al., 2024）。它在发酵食品中的长期安全使用历史、不产生内毒素的特性以及固有的益生菌特性，使其在生产食品级抗菌剂方面比传统宿主Escherichia coli具有明显优势。通过工程改造乳酸菌使其表达和分泌异源AMPs，不仅简化了下游纯化过程，还为开发具有天然防腐功能的新型发酵剂提供了可能性。尽管如此，开发高效的乳酸菌表达系统以生产AMPs，以及对其机制的研究和重组肽的应用验证，仍需进一步研究。

在本研究中，我们构建了一种重组Lactococcus lactis NZ9000菌株，用于表达和分泌新型抗菌肽SH。随后，我们优化了该重组菌株的表达条件并纯化了该肽以进行进一步表征。我们对SH的抗菌机制进行了全面研究，包括其抗菌活性、生物相容性、膜破坏作用、呼吸链脱氢酶的抑制作用以及细胞内物质的泄漏。此外，还评估了纯化SH在多种pH值、温度和NaCl条件下的稳定性。最后，在真实食品系统（新鲜榨取的橙汁）中证明了其作为天然防腐剂的效力。本研究提出了一种策略，将食品级AMP生产系统的开发与其应用相结合，为饮料行业设计新型生物防腐剂提供了思路。

部分内容摘录

细菌菌株、质粒和引物

本研究中使用的细菌菌株由东北农业大学动物科学与技术学院提供。所有相关质粒和引物列于表1中。限制性内切酶和质粒提取试剂盒均从南京瓦兹迈生物技术有限公司购买。

重组菌株的构建与表征

为了促进抗菌肽SH的分泌和后续纯化，我们设计了一个融合构建体。该构建体包含Usp45分泌

设计并构建表达重组抗菌肽SH的L. lactis

虽然氯化钠（NaCl）是一种基本且低成本的食品成分，其在改善风味、质地和防腐方面的作用得到了广泛认可，但利用氯离子（Cl^-）作为乳酸菌中重组基因表达的诱导剂的研究仍较少（Mingyang Hu et al., 2025b; Hu et al., 2024）。因此，本研究开发了一种新的表达系统，采用氯离子诱导型启动子，以提供更经济且食品安全的替代方案。

结论

本研究建立了在NaCl诱导下L. lactis生产食品级抗菌肽SH的系统。重组SH对主要的革兰氏阴性食源性病原体表现出强烈的选择性活性，对哺乳动物细胞的毒性极低，且对有益益生菌无不良影响。此外，它在各种食品加工条件下也表现出优异的稳定性。机制研究表明，SH作用于多个细胞组分：它能够结合脂多糖（LPS）,

CRediT作者贡献声明

Lu Zhao：监督。Chenyu Xue：撰写 – 审稿与编辑，验证。Yutong Xue：形式分析，数据管理。Mingyang Hu：撰写 – 原稿，方法学。Yuwen Li：可视化，数据管理。Sina Cha：验证，数据管理。Anshan Shan：方法学，资金获取。Na Dong：撰写 – 审稿与编辑，方法学，资金获取

未引用参考文献

He et al., 2025; Hu et al., 2025a; Hu et al., 2025b; Zhou et al., 2025.

数据可用性

所有相关数据均包含在手稿中。

利益冲突

作者声明不存在利益冲突

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。

致谢

资助本研究得到了中国国家重点研发计划（2022YFD1300702）、国家自然科学基金（项目编号U21A20252和32030101）、黑龙江省科技创新基地奖励计划（JD24A004）、中国农业研究体系（CARS-35）以及东北农业大学青年领军人才支持项目（NEAU2023QNLJ-017）的财政支持。