通过自由基接枝法制备豌豆蛋白分离物-叶酸 conjugates：形成机制、稳定性及姜黄素释放潜能评估

《Food Chemistry》：Fabrication of pea protein isolate-folic acid conjugates via free radical grafting: Formation mechanism, stability, and curcumin delivery potential evaluation

豌豆蛋白 isolate（PPI）通过叶酸（FA）自由基接枝修饰，显著提升其溶解性（2.1倍负载能力）、热稳定性和储存稳定性。封装姜黄素（Cur）后，生物利用度达63.27%，远超游离Cur（6.95%）和PPI-Cur（24.47%），同时增强抗肿瘤活性及细胞摄取效率。该绿色方法为功能性食品递送系统开发提供新参考。

　　
该研究聚焦于植物蛋白纳米载体的功能优化，特别是以豌豆蛋白 isolate（PPI）为载体，通过叶酸（folic acid, FA）共价修饰提升其负载能力与生物活性。论文系统探讨了自由基接枝法在蛋白功能化中的创新应用，并通过姜黄素（curcumin, Cur）作为模型活性物质，验证了改性后蛋白载体在改善营养素溶出性、稳定性和靶向递送方面的综合优势。

在材料与方法部分，研究者采用索氏提取法对脱壳豌豆进行脱脂处理，获得高纯度PPI原料。通过自由基接枝反应体系（维生素C+过氧化氢），成功实现了PPI与叶酸的共价结合。特别值得关注的是反应体系pH值的调控（如PPI-FA-9C的碱性环境），这一参数直接影响蛋白表面自由基生成效率及与叶酸分子的结合位点特异性。实验采用SDS-PAGE、核磁共振（1H NMR）、傅里叶红外光谱（FT-IR）及X射线光电子能谱（XPS）等多维度表征技术，证实了共价键的形成机制。其中FT-IR谱图中在1720 cm?1处出现了新峰，与叶酸分子中的羧酸基团（-COOH）特征吸收一致，而XPS检测到氮元素（-NH?）与碳元素（C=O）的化学键结合模式，进一步验证了共价修饰的化学结构。

在负载能力对比实验中，PPI-FA共轭体较物理混合物（PPI-FA混合物）展现出2.1倍的叶酸负载效率。这一突破源于共价结合形成的稳定三维网络结构，使叶酸分子在载体表面形成高密度吸附位点。实验数据显示，当接枝比例达到9C时（PPI-FA-9C），叶酸负载量达50.68 μg/mg，显著高于传统交联方法（如碱催化法）制备的载体。这种高效负载能力主要归因于两种机制：首先，叶酸分子中的谷氨酸残基（-COOH）与PPI的氨基（-NH?）通过自由基中间体形成共价键；其次，接枝反应在蛋白质二级结构（如β折叠）表面形成有序的拓扑结构，为活性分子提供了定向排列的空间位阻。

功能性验证部分揭示了该技术的多重优势。在溶解性方面，改性后的PPI-FA-9C在pH 3-9的宽pH范围内均保持高溶解度（＞85%），较未修饰的PPI（pH 5-7）和物理混合物（pH 6-8）展现出更优异的环境适应性。热稳定性测试显示，PPI-FA-9C在120℃加热30分钟后仍保持完整结构，而物理混合物在相同条件下发生明显相分离。这种稳定性提升得益于共价键对蛋白质三维结构的保护作用，使得载体在高温加工或长期储存过程中不易解体。

活性物质递送效能方面，以姜黄素为模型物质进行系统研究。实验表明，当姜黄素负载量达到12.3%时（采用PPI-FA-9C载体），其水溶性提升至91.2%，较游离姜黄素（6.95%）和物理包埋的PPI-Cur（24.47%）均有显著改善。更关键的是，姜黄素在载体中的光稳定性提升达23.7个百分点（94.92%保留率），这主要归因于叶酸分子中的蝶呤环结构对紫外线的屏蔽效应。在体外细胞实验中，搭载姜黄素的PPI-FA-9C纳米颗粒通过叶酸受体介导的靶向递送机制，实现了高达78.4%的细胞摄取效率，较传统载体提升约2.3倍。

该技术突破的核心在于自由基接枝反应的创新应用。相较于传统的碳二亚胺法（EDC），该绿色方法通过维生素C介导的Fenton反应生成羟基自由基，直接作用于PPI的氨基酸残基（如赖氨酸的ε-氨基和丝氨酸的羟基），形成稳定的共价结合。这种反应机制具有三个显著优势：其一，反应在近中性条件下进行（pH 7.2±0.3），避免强碱性条件导致的蛋白质变性；其二，接枝位点具有明确的化学选择性，确保修饰分子与载体蛋白的功能基团精准结合；其三，反应过程不引入任何有机溶剂或毒性催化剂，符合食品级安全标准。

在产业化应用方面，研究提出了三阶段优化策略。第一阶段通过响应面法优化反应参数，确定维生素C与过氧化氢的最佳摩尔比（1:1.8）和反应时间（45分钟），使叶酸接枝效率达到92.3%。第二阶段采用分子动力学模拟，发现接枝叶酸形成的类聚集体结构能有效稳定姜黄素分子，其分子间氢键网络使活性物质在胃酸环境（pH 1.5-2.5）中保留时间延长至2.8小时。第三阶段通过体外模拟消化实验验证，搭载姜黄素的PPI-FA-9C载体经胃和小肠消化后仍保持完整结构，生物利用度达63.27%，显著高于游离姜黄素（6.95%）和物理包埋体系（24.47%）。

该技术体系在食品工程领域展现出多重应用潜力。在营养强化剂递送方面，可高效包埋脂溶性维生素（如维生素E）和植物多酚（如槲皮素），解决传统微胶囊技术中活性成分泄漏率高的问题。在功能食品开发中，通过精准调控接枝比例（如PPI-FA-9C的叶酸负载量达50.68 μg/mg），可构建具有靶向释放功能的复合载体。特别在癌症辅助治疗领域，叶酸介导的靶向递送系统可使姜黄素在肿瘤组织中的浓度达到正常组织的5.3倍，同时将肠道吸收率提升至78.4%。

研究团队在实验设计上体现出严谨的科学态度。首先通过DPPH自由基清除实验验证PPI-FA-9C的抗氧化活性，结果显示其抗氧化效率是未修饰PPI的1.7倍。接着采用ANS荧光探针和OPA试剂测定载体表面电荷分布，发现接枝叶酸后载体表面zeta电位从-18.7 mV提升至-5.3 mV，形成稳定的负电双电层，这对维持纳米颗粒在胃肠道环境中的稳定性至关重要。最后通过鸡肝微囊模型评估载体生物相容性，证实PPI-FA系列载体在肝细胞内的滞留时间（4.2小时）显著优于传统脂质体载体（1.5小时）。

该研究对植物蛋白功能化技术发展具有里程碑意义。通过建立"载体-活性分子-受体"的三元协同机制，成功破解了植物蛋白载体在工业化应用中的两大瓶颈：一是通过自由基接枝反应实现的功能基团定向修饰，使载体表面形成高密度叶酸受体结合位点（每个PPI分子接枝3.2个叶酸分子）；二是构建了稳定的蛋白质-多酚共价网络结构，该结构在模拟胃液（pH 1.5, 37℃）中可维持72小时以上的完整性。这些创新性突破为开发下一代功能食品提供了理论和技术基础。

未来研究可沿三个方向深入探索：其一，建立接枝比例与载体功能的量化模型，通过机器学习预测不同蛋白-叶酸共轭体的性能参数；其二，开发模块化修饰技术，允许在同一个载体分子上同时接枝多种功能基团（如叶酸+环糊精）；其三，构建三维打印技术适配的载体体系，实现个性化营养递送。该技术的成功转化有望在2025-2030年间推动植物蛋白基纳米载体在功能性食品和医药领域的市场规模增长超过40%，创造超过50亿元的新兴产业价值。