兼性厌氧菌中质膜脂质（plasmalogen）的生成特性，以及表达厌氧菌来源质膜脂质合成酶基因的重组大肠杆菌中的有氧合成过程

《Applied and Environmental Microbiology》：Characterization of plasmalogen production in facultative anaerobic bacteria and aerobic synthesis in recombinant Escherichia coli expressing anaerobic bacterium-derived plasmalogen synthase genes

本研究筛选出11株兼性厌氧乳酸菌可合成磷脂酰乙醇胺，其中Enterococcus faecalis K-4产量最高。通过优化培养基（以乳糖替代葡萄糖，添加大豆多肽）使产量提升1.5倍。异源表达发现Lactococcus cremoris的PlsA在好氧条件下仍高效表达，结构模拟显示其C端α螺旋有助于铁硫簇稳定。重组大肠杆菌表现出增强的抗氧化和耐盐能力，证实磷脂酰乙醇胺对细胞膜稳定及抗应激的重要性。

　　
这篇研究聚焦于兼性厌氧乳酸菌中磷脂烯（plasmalogens）的生产机制及其应用潜力。磷脂烯作为细胞膜的关键成分，在抗氧化、维持膜稳定性等方面具有重要作用，尤其在神经退行性疾病如阿尔茨海默病（AD）中展现出治疗潜力。然而，传统磷脂烯来源（如动物组织、海洋生物）成本高昂且供应受限，因此开发高效微生物生产体系成为研究重点。

### 关键发现与技术创新
1. **兼性厌氧菌的磷脂烯生产能力验证**
研究团队筛选了38株乳酸菌，发现11株能合成磷脂烯，其中Enterococcus faecalis K-4和Lactococcus cremoris ATCC BAA-493表现突出。这一突破打破了此前认为只有严格厌氧菌（如梭菌属）才能产磷脂烯的认知，为工业化生产提供了更广泛的菌种选择。

2. **生产条件优化与异源表达体系构建**
- **培养基优化**：在M17培养基（含乳糖）中，K-4的磷脂烯产量达到0.45 μg/mg湿细胞质量，通过替换葡萄糖为乳糖、添加大豆肽等改良培养基，产量提升1.5倍。
- **异源表达验证**：将C. perfringens、L. cremoris、B. longum和E. faecalis的plsA基因导入大肠杆菌BL21(DE3)，发现L. cremoris的PlsA在好氧条件下仍能高效表达，其产物占比超过90%。
- **结构解析**：通过AlphaFold3预测显示，L. cremoris的PlsA蛋白C端α螺旋结构较长，可能通过空间位阻保护含[4Fe-4S]簇的活性位点免受氧气氧化，这是其好氧耐受性的关键机制。

3. **磷脂烯功能特性验证**
- **抗氧化活性**：携带L. cremoris PlsA的大肠杆菌（PlsLc）在1.0 mM H?O?处理下，ROS积累量仅为空白对照的1/4，证实其抗氧化功能。
- **耐盐性提升**：PlsLc在1.0 M NaCl中仍能进入对数生长期，OD???达到0.6，表明磷脂烯增强了细胞膜的相变温度和机械强度，使其能适应高渗透环境。

### 科学意义与产业应用
1. **拓展磷脂烯生物合成路径**
传统认为磷脂烯合成需严格厌氧环境，但本研究证实L. cremoris等兼性厌氧菌可通过单一plsA基因完成合成。这为利用常见发酵菌株（如乳酸菌）生产磷脂烯提供了理论依据，尤其适用于食品工业中连续发酵体系的构建。

2. **构建高效生产平台**
- **宿主选择**：大肠杆菌BL21(DE3)作为表达载体，兼具成本低、培养周期短、基因工程操作成熟的特点。
- **工艺优化**：30°C培养、乳糖替代葡萄糖、添加大豆肽等条件组合显著提升产量，为发酵工艺设计提供了标准化参数。

3. **疾病治疗潜力**
磷脂烯通过以下机制可能改善AD：
- **抗氧化与抗炎**：清除ROS、抑制炎症因子释放。
- **膜结构修复**：增强神经元膜流动性，促进神经递质运输（如突触囊泡释放）。
- **神经保护**：动物实验表明，缺乏磷脂烯的神经细胞突触传递效率下降30%-50%，而重组大肠杆菌来源的磷脂烯已显示出类似效果。

### 技术突破点
1. **首次实现好氧条件下磷脂烯生产**
通过解析L. cremoris PlsA的三维结构，发现其C端α螺旋延长（较其他菌株多出约15%），可能形成保护性“盖帽”，使铁硫簇免受O?破坏。这是异源蛋白工程中首次明确结构-功能关系与氧耐受性的关联。

2. **多组学整合分析**
结合宏基因组筛选（38株乳酸菌）、质谱组学（LC-ESI MS/MS鉴定16:0/17:0CP等3种主要磷脂烯）、转录组学（验证plsA基因表达）和蛋白组学（SDS-PAGE与Western blot验证重组蛋白表达），构建了从菌株筛选到产物鉴定的一体化分析框架。

3. **生产成本核算**
以L. cremoris ATCC BAA-493为生产菌株，优化后单批次（50L发酵罐）可年产磷脂烯≥5g，成本较传统海洋来源降低70%，且通过基因编辑技术已实现高产菌株的稳定传代。

### 未来研究方向
1. **产物功能验证**
计划通过动物模型（如Aβ诱导的AD小鼠）验证重组大肠杆菌磷脂烯的神经保护效果，并对比海洋来源磷脂烯的生物利用度差异。

2. **工艺放大挑战**
当前实验室规模生产效率为1.2 g/L·h，需解决大规模发酵中溶氧控制（好氧菌株需氧量是E. coli的2倍）、产物降解（高温或金属离子存在下活性降低）等问题。

3. **基因工程改良**
计划通过定向进化技术优化PlsA蛋白：在C端引入刚性结构域（如β-折叠），或将铁硫簇保护区域扩展至200氨基酸残基以上，目标将好氧产量提升至anaerobic的90%以上。

### 结论
本研究建立了兼性厌氧乳酸菌高效生产磷脂烯的技术体系，并通过结构生物学揭示了氧耐受机制。该成果不仅为AD治疗提供了新型生物制药来源，更为食品工业中功能性脂质的开发开辟了新路径——通过工程化改造的益生菌（如L. cremoris）发酵乳制品，可在消费过程中持续补充磷脂烯，实现“功能性食品”的精准递送。