HG002基因组亚克隆变异基准集的建立：为体细胞与嵌合变异检测提供标准化资源

《Cell Genomics》：Characterization of subclonal variants in HG002 Genome in a Bottle reference material as a resource for benchmarking variant callers

本研究针对当前缺乏低频率体细胞与嵌合变异检测标准基准的难题，通过扩展"瓶中基因组（GIAB）"计划中HG002参考材料的变异表征范围，首次构建了包含85个高置信度亚克隆单核苷酸变异（SNV）的基准集，覆盖2.45 Gbp基因组区域。研究人员利用家系三重测序数据结合多平台正交验证策略，建立了可可靠识别假阴性与假阳性变异的评价体系。该资源为开发精准的体细胞突变检测工具提供了关键质量控制基础，对癌症基因组学与遗传病研究具有重要意义。

　　

在基因组学研究领域，准确检测体细胞与嵌合变异对于癌症诊断、遗传病机制解析乃至衰老研究具有关键意义。然而，由于这类变异通常以低频率存在于细胞群体中（变异等位基因频率（VAF）<30%），其检测面临灵敏度与特异性的双重挑战。更棘手的是，科学界长期缺乏经过严格验证的参考标准来评估不同检测方法的性能，导致结果可比性差、技术优化缺乏明确方向。这一瓶颈严重制约了精准医疗中低频变异检测技术的标准化进程。

为破解这一难题，由美国国家标准与技术研究院（NIST）领导的"瓶中基因组（GIAB）"联盟在《Cell Genomics》发表了突破性研究成果。研究团队选取已被深度表征的HG002淋巴母细胞系（来自阿什肯纳兹犹太人家系）作为模型，通过创新性地整合家系信息与多组学技术，首次构建了针对亚克隆变异的高置信度基准集。该工作将GIAB基准资源的应用范围从传统生殖系变异拓展至低频率变异领域，为相关方法学开发提供了"金标准"。

研究团队采用多层次技术策略确保基准集的可靠性。核心方法包括：基于家系三重设计（HG002及其父母HG003/HG004）的Strelka2体细胞变异调用，通过300×全基因组测序（WGS）数据初步筛选候选变异；利用BGI（100×）、Element（136×）和PacBio HiFi（106×）等多平台正交测序数据交叉验证；建立统计模型计算变异等位基因频率的置信区间（99%单侧置信区间下限≥5%）；通过人工核查排除映射错误、批次效应等干扰因素。最终确定的基准区域覆盖2.45 Gbp常染色体区域，并采用可靠错误识别（RIDE）原则验证其评价效能。

基准集特征分析

研究结果显示，HG002参考材料（NIST RM 8391）中共鉴定出85个VAF介于5%-30%的亚克隆SNV，其中15%位于医学相关基因区域。值得注意的是，基准集特意排除了复杂基因组区域（如串联重复序列、同聚物区域），以确保变异呼叫的准确性。通过比较不同批次细胞系（NIST RM与Coriell非RM样本）的数据，研究首次发现亚克隆变异存在显著的批次效应——非RM样本中多个变异的VAF显著偏高，提示细胞培养过程中可能产生遗传漂变。这一发现强调使用标准参考材料对基准测试的重要性。

外部验证与性能评估

为验证基准集的普适性，8个独立研究团队使用不同技术流程（包括DRAGEN、DeepSomatic、TNscope等）对基准集进行盲法测试。结果显示，≥87%的基准变异能被高覆盖率数据集正确识别，而外部呼叫集中未被基准集收录的变异经人工核查后，绝大多数被确认为映射错误或批次效应所致。特别发现一个被家系分析法遗漏的真实嵌合变异（chr10:106867519），该变异在HG002中为新发事件，而在父亲HG003中为生殖系杂合变异，提示家系分析法可能遗漏与亲本变异共定位的嵌合事件。这一案例凸显了基准集在发现方法局限性方面的价值。

讨论与展望

本研究建立的基准集突破了传统GIAB资源仅覆盖高频变异（VAF≥30%）的限制，为体细胞/嵌合变异检测提供了关键的质量控制工具。其创新性体现在三个方面：首先，利用家系设计有效区分生殖系与体细胞变异；其次，通过多平台正交数据确保变异的可靠性；最后，通过外部验证证明其在不同技术流程中的适用性。值得注意的是，基准集目前仅包含SNV且数量有限，未来需要整合更多变异类型（如插入缺失（indel））并探索更低频率（VAF<5%）变异的检测方法。

该资源已被美国医疗设备创新联盟（MDIC）的"体细胞参考样本（SRS）计划"选为基准平台，用于评估CRISPR基因编辑等技术的脱靶效应。随着NIH"人体组织体细胞嵌合现象（SMaHT）"等大型项目的推进，这一基准集将为建立更全面的体细胞变异图谱提供重要技术支撑，最终推动精准医疗中低频变异检测的标准化与临床应用。