驱动蛋白嵌合体揭示结构域功能：头颈尾协同调控纺锤体动力学与非整倍体发生

《Current Biology》：Chimeras of kinesin-6 and kinesin-14 reveal head-neck-tail domain functions and dysfunctions that lead to aneuploidy in fission yeast

本研究针对驱动蛋白结构域功能不清的问题，通过构建裂殖酵母kinesin-6/Klp9与kinesin-14/Pkl1的嵌合体，揭示了尾部决定定位与方向性、颈部调控头部活性、头部功能障碍导致非整倍体的新机制，为理解细胞分裂调控及肿瘤发生提供了新视角。

　　

在细胞分裂的精密舞台上，驱动蛋白（kinesin）扮演着至关重要的角色，它们如同分子马达，在微管（microtubule, MT）轨道上行走，负责运输货物、组装纺锤体并最终确保染色体被精确地分离到两个子细胞中。这些分子马达通常由三个主要结构域组成：负责结合微管并水解ATP提供动力的头部（head）、连接头部与尾部的颈部（neck），以及负责寡聚化和与其他蛋白相互作用的尾部（tail）。有趣的是，尽管不同驱动蛋白的头部结构高度相似，但它们却拥有截然不同的行走方向：一些走向微管的加端（plus-end），另一些则走向减端（minus-end）。更令人困惑的是，体外研究表明，决定行走方向的并非头部，而是颈部。那么，在活细胞中，驱动蛋白的头部、颈部和尾部究竟各自扮演着怎样的角色？它们如何协同工作以确保细胞分裂的准确性？一旦这些结构域的功能出现紊乱，又会导致怎样的灾难性后果？

为了回答这些问题，来自法国居里研究所的Priyanka Sasmal、Phong T. Tran及其团队在《Current Biology》杂志上发表了一项开创性研究。他们选择裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）作为模型，系统性地构建了两种关键驱动蛋白——kinesin-6/Klp9和kinesin-14/Pkl1——的嵌合体，通过“拆解”与“重组”的策略，在活细胞中精确揭示了每个结构域的功能，并发现其功能障碍会通过截然不同的途径导致非整倍体（aneuploidy）的发生。

关键技术方法

本研究主要采用了分子生物学、细胞生物学和活细胞成像技术。研究人员利用Gibson Assembly等方法，系统性地构建了裂殖酵母kinesin-6/Klp9和kinesin-14/Pkl1的嵌合体及截短体，并在其内源性基因位点进行表达。通过活细胞延时成像技术，研究人员实时观察了纺锤体动力学和染色体分离过程。此外，研究还运用了光漂白恢复（FRAP）技术来测量马达蛋白的运动速度，以及人工微染色体丢失实验来定量评估染色体分离错误率。

研究结果

尾部决定马达蛋白在纺锤体上的定位

研究人员首先构建了一系列Klp9和Pkl1的嵌合体，分别将它们的头部、颈部和尾部进行交换。令人惊讶的是，无论马达的头部是来自Klp9还是Pkl1，也无论颈部是否存在或来自哪个蛋白，决定其在纺锤体上定位的关键因素始终是尾部。例如，将Klp9的头部和颈部与Pkl1的尾部融合（K9hn:P1t），该嵌合体不再定位于纺锤体中部，而是像野生型Pkl1一样定位于纺锤体极（spindle pole）。反之，将Pkl1的尾部替换为Klp9的尾部（K9t:P1nh），该嵌合体则从纺锤体极转移到了纺锤体中部。这一结果清晰地表明，在活细胞中，驱动蛋白的尾部是决定其定位的主导因素。

颈部调控马达头部的活性

接下来，研究人员通过分析纺锤体伸长动力学，探究了颈部对马达功能的影响。他们发现，缺失颈部的Klp9（K9h:K9t）虽然仍能定位于纺锤体中部并驱动纺锤体伸长，但其速度比野生型Klp9（K9hnt）慢约15%。更有趣的是，当将Klp9的颈部替换为Pkl1的颈部时（K9h:P1n:K9t），其速度也显著降低。这些结果表明，Klp9的颈部对马达头部的活性具有正向调控作用，而Pkl1的颈部则可能具有负向调控作用。为了进一步验证这一点，研究人员比较了P1h:K9nt（Pkl1头部+Klp9颈部尾部）和P1hn:K9t（Pkl1头部+Klp9尾部，无颈部）两个嵌合体。结果显示，拥有Klp9颈部的P1h:K9nt其纺锤体伸长速度比没有颈部的P1hn:K9t快约1.5倍，这再次证实了Klp9颈部对马达活性的正向调控作用。

嵌合体P1h:K9nt以快于野生型Klp9的速度拉长纺锤体

一个引人注目的发现是，嵌合体P1h:K9nt（Pkl1头部+Klp9颈部尾部）的纺锤体伸长速度比野生型Klp9快约1.5倍。这种异常快速的伸长导致纺锤体在细胞末端发生弯曲，甚至断裂。通过光漂白恢复实验，研究人员证实，这种速度的加快并非源于马达数量的增加，而是因为Pkl1头部本身具有比Klp9头部更快的微管滑动速度。当Pkl1头部被“嫁接”到Klp9的颈部和尾部上时，它被“劫持”到了纺锤体中部，并以更快的速度滑动微管，从而导致了纺锤体的异常动力学。

异常快速的纺锤体伸长导致非整倍体

这种异常快速的纺锤体伸长带来了灾难性的后果。在约2%的细胞中，过快的伸长速度导致纺锤体在后期（anaphase B）发生弯曲和断裂。这使得姐妹染色单体无法在细胞分裂前被完全分离，最终导致染色体分离错误，产生非整倍体细胞。这一结果通过人工微染色体丢失实验得到了验证，P1h:K9nt嵌合体菌株的染色体丢失率约为2%，与活细胞成像观察到的纺锤体断裂频率高度一致。

Pkl1嵌合体无法阻止异常的微管突起

在Pkl1嵌合体系列中，研究人员观察到了另一种导致非整倍体的途径。Pkl1的主要功能是定位于纺锤体极，聚焦微管，防止异常的微管突起。然而，所有Pkl1嵌合体（如P1tn:K9h，即Klp9头部+Pkl1颈部尾部）和截短体，尽管能够定位于纺锤体极，却都无法阻止异常微管突起的发生，其表型与Pkl1缺失突变体（P1△）相似。进一步的分析表明，这些嵌合体在纺锤体极的信号强度显著低于野生型Pkl1，提示其功能缺陷可能是由于在纺锤体极的马达数量不足所致。

异常长的纺锤体微管突起导致非整倍体

这些异常的微管突起会物理性地将已经分离的染色体推回细胞中央。当细胞进行胞质分裂时，这些位于细胞中央的染色体被“切割”，导致一个子细胞获得过多的染色体，而另一个子细胞则丢失染色体，从而产生非整倍体。人工微染色体丢失实验证实，所有Pkl1嵌合体菌株均表现出较高的染色体丢失率（约8%-11%），进一步验证了这种非整倍体发生途径。

研究结论与讨论

这项研究通过巧妙的嵌合体设计，在活细胞中清晰地揭示了驱动蛋白各结构域的功能分工：尾部决定定位，颈部调控头部活性，而头部则负责产生结合和滑动微管的力量。更重要的是，研究揭示了驱动蛋白功能障碍导致非整倍体的两种截然不同的分子途径。一种途径源于马达头部活性的异常增强（如P1h:K9nt），导致纺锤体伸长过快而断裂；另一种途径则源于马达在纺锤体极的定位或功能不足（如Pkl1嵌合体），导致微管聚焦失败，产生异常的微管突起。这两种途径最终都破坏了染色体分离的精确性，导致非整倍体的发生。

该研究不仅证实了体外研究的部分结论，也揭示了活细胞中更为复杂的调控机制。例如，研究发现在活细胞中，尾部而非颈部是决定马达定位和方向性的主要因素，这与部分体外研究的结果存在差异，提示了细胞环境对马达功能的重要影响。此外，研究还发现Pkl1头部本身具有比Klp9头部更快的滑动速度，这一发现为理解不同驱动蛋白的进化适应提供了新的线索。

这项研究的意义在于，它首次在活细胞中系统性地阐明了驱动蛋白各结构域的功能，并揭示了驱动蛋白功能障碍导致非整倍体的具体分子机制。非整倍体是癌症等许多人类疾病的重要特征，因此，理解驱动蛋白如何调控细胞分裂的精确性，对于揭示疾病发生机制和开发新的治疗策略具有重要的指导意义。