急性髓系白血病通过AHR依赖性扩增3型固有淋巴细胞塑造促肿瘤微环境

《Leukemia》：Leukemia-driven expansion of type 3 innate lymphoid cell facilitates a pro-tumoral microenvironment in acute myeloid leukemia

【推荐语】急性髓系白血病（AML）患者生存率低，免疫失调机制亟待阐明。本研究聚焦非NK细胞的固有淋巴细胞（ILC），发现AML通过芳香烃受体（AHR）通路驱动3型固有淋巴细胞（ILC3）扩增，并证实其通过分泌GM-CSF和TNFα促进白血病增殖。该研究揭示了AML免疫逃逸新机制，为靶向ILC3-AML轴提供了治疗新思路。

　　

急性髓系白血病（AML）是一种起源于骨髓的侵袭性血液恶性肿瘤，尽管现代细胞和靶向治疗取得了进展，但患者的5年总生存率仍低于35%。异基因造血干细胞移植（alloHSCT）联合化疗是部分AML患者的潜在治愈选择，但并非所有患者都符合移植条件，且移植后并非都能获得持久缓解。因此，亟需深入了解AML如何与免疫系统相互作用并实现免疫逃逸，以改善患者预后。

固有淋巴细胞（ILCs）是免疫系统的重要组成部分，根据功能可分为三类：1型ILC（包括自然杀伤细胞NK和ILC1）、2型ILC（ILC2）和3型ILC（ILC3和淋巴组织诱导细胞LTi）。先前研究表明，NK细胞具有强大的抗白血病效应功能，可延缓疾病进展。然而，在AML环境中，NK细胞的发育和功能存在缺陷，且成熟缺陷与较差的临床结局相关。除了NK细胞，其他ILC亚群在癌症中的作用仍在探索中。其中，ILC3s在稳态情况下主要存在于黏膜组织，通过分泌细胞因子（如IL-17、IL-22）调节黏膜免疫。值得注意的是，ILC3s也已被证明可分泌肿瘤坏死因子α（TNFα）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）。在实体瘤（如胰腺癌）中，ILC3s可通过IL-22/AKT轴促进肿瘤生长，但它们在AML中的作用尚不清楚。早期研究提示AML患者的ILC3s存在失调，但当时对ILC3的定义尚不完善。随着对ILC认识的深入，现在知道表达NKp44可以区分组织驻留的ILC3s（NKp44+）和共同的ILC前体细胞（ILCPs， NKp44-）。因此，有必要在AML中对ILC3的生成和功能进行深入分析。

发表在《Leukemia》上的这项研究旨在阐明ILC3s在AML发生发展中的作用及其机制。研究人员发现，在AML小鼠模型和初治AML患者的骨髓中，ILC3s显著扩增。这种扩增是由AML细胞来源的芳香烃受体（AHR）配体激活AHR通路，从而促使ILC前体（ILCP）向ILC3分化所驱动。在白血病环境下产生的ILC3s细胞因子分泌能力增强，特别是GM-CSF和TNFα。通过共培养实验和体内实验，研究证实ILC3s通过分泌这些细胞因子显著促进了AML细胞的增殖和集落形成。更重要的是，将ILC3s与AML细胞共移植到小鼠体内会加速疾病进展。临床数据分析显示，AML患者骨髓中ILC3s的频率与原始细胞负荷呈正相关，并且在高危患者中更为富集。这些结果揭示了AML通过AHR-ILC3轴塑造促肿瘤微环境的新机制，为AML的免疫治疗提供了新的潜在靶点。

本研究综合运用了多种关键技术方法。在模型系统上，研究人员使用了模拟人AML的Mll-PTD; Flt3-ITD双敲入小鼠模型，并进行了异体移植。临床样本来源于初治AML患者的骨髓。细胞分析技术包括流式细胞术进行免疫表型鉴定和细胞内细胞因子检测，以及单细胞RNA测序（scRNA-seq）进行无偏倚的细胞群体分析。功能研究手段涵盖体外集落形成单位（CFU）测定、细胞共培养增殖实验（MTS法）、以及利用病毒样颗粒（VLP）进行CRISPR/Cas9基因编辑以敲低ILC3s中的特定基因（TNF, CSF2）。体内功能验证则通过将人源ILC3s与AML细胞系共移植到免疫缺陷（NSG）小鼠中进行。

ILC3s在白血病小鼠和原发性AML患者中扩增

为了研究AML环境中的ILC，研究人员使用了Mll-PTD; Flt3-ITD（PTD/ITD）双敲入小鼠AML模型。对白血病小鼠和对照小鼠骨髓中Lin^-CD45.1⁺细胞进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析，发现了一个在白血病小鼠中特异性富集的细胞簇（簇14）。该簇表达Rorc（编码RORγt）、Il7r、Il23r，但不表达Eomes或Gata3，符合ILC3的转录特征。流式细胞术验证表明白血病小鼠骨髓和肠道中的ILC3（Lin^-ST2^-CD49b^-Gata3^-Eomes^-CD127⁺RORγt⁺）频率和绝对数量均显著高于对照小鼠。基因本体（GO）分析显示该ILC3簇富集于细胞因子产生和细胞活化相关通路，包括NF-κB通路激活。在人类样本中，初治AML患者骨髓中定义的ILC3（Lin^-CD56⁺CD94^-CD294^-NKp80^-EOMES^-NKp44⁺RORγT⁺）频率和绝对数量也显著高于健康供体。这些数据表明，ILC3在AML的骨髓微环境中扩增且处于活化状态。

AML促进人ILC3的发育

为了探究AML是否主动促进ILC3发育，研究建立了体外共培养系统和体内移植模型。将健康供体外周血分离的ILC前体（ILCP）与AML细胞系（U937或MV-411）在transwell中共培养4周后，ILC3的生成显著增加。同样，将人ILCP与AML细胞系（MV-411）共移植到NSG小鼠体内4周后，小鼠骨髓中人源ILC3的数量也显著高于仅移植ILCP的对照组。这些结果说明AML能够从ILCP阶段促进ILC3的发育。

AML以AHR依赖性方式促进ILC3发育

芳基烃受体（AHR）是ILC3发育和功能的关键转录因子，且已知AML原始细胞可分泌AHR配体。在ILCP与AML细胞的共培养体系中，加入AHR拮抗剂CH-223191（AHRi）可抑制AML诱导的ILC3扩增，而加入AHR激动剂FICZ则能模拟AML的效果，促进ILC3生成。此外，通过单细胞克隆实验发现，在AML条件培养基中培养的单个ILCP更倾向于分化为ILC3，此效应可被AHRi逆转。这些发现表明，AML通过激活AHR信号通路，促使ILCP的分化偏向ILC3。

ILC3在AML中功能亢进

对白血病小鼠骨髓ILC3的功能分析显示，其增殖标志物Ki67表达升高。经刺激后，白血病小鼠骨髓来源的ILC3产生的GM-CSF、TNFα和IL-2显著高于对照小鼠。与之相反，白血病小鼠肠道中的ILC3则表现出不同的细胞因子谱，GM-CSF和TNFα降低而IL-22增加，提示AML对ILC3功能的影响具有组织特异性。在人类系统中，将正常供体ILC3与AML细胞系共培养3天后，其GM-CSF、TNFα和IL-22的产生也显著增加。对初治AML患者骨髓单个核细胞直接 ex vivo 刺激后，其ILC3产生的TNFα也高于健康供体。这些结果表明，AML微环境诱导ILC3产生非经典的促炎细胞因子，特别是GM-CSF和TNFα。

ILC3促进AML增殖和集落形成

功能上，将人源ILC3与多种AML细胞系共培养可促进后者增殖。更重要的是，将小鼠或人源ILC3与AML原始细胞共培养进行集落形成单位（CFU）测定，发现ILC3能显著增加白血病集落数量。对CFU培养后的ILC3进行基因表达分析，发现其CSF2（编码GM-CSF）和TNF（编码TNFα）转录本水平升高。在CFU培养体系中加入TNFα抑制剂（Benpyrine）或GM-CSF中和性单克隆抗体，均可部分逆转ILC3对集落形成的促进作用。为了特异性验证ILC3来源细胞因子的作用，研究人员利用CRISPR/Cas9病毒样颗粒（VLP）系统敲低原代扩增的人ILC3中的TNF或CSF2基因。与转导乱序向导RNA（scramble guide）的ILC3相比，与TNF或CSF2敲低的ILC3共培养的AML细胞形成的集落数显著减少。这证实了ILC3来源的TNFα和GM-CSF在促进AML集落形成中起关键作用。

ILC3促进体内AML进展并与患者不良预后相关

为了在体内验证ILC3的促白血病作用，将人AML细胞系MV-411与正常人ILC3以1:2的比例共移植到NSG小鼠中。与单独移植AML细胞的小鼠相比，共移植ILC3的小鼠在收获时骨髓和血液中的白血病负荷（hCD45⁺NKp44^-原始细胞）显著更高，且疾病进展更快，生存期缩短。在临床相关性方面，分析AML患者数据发现，骨髓中ILC3的频率与外周血原始细胞百分比呈正相关。根据欧洲白血病网络（ELN）风险分层，高危组患者骨髓中ILC3频率显著高于中危和低危组。此外，与伴有KMT2A/NPM1或CBF（核心结合因子）突变的AML相比，骨髓增生异常相关AML（MR-AML）患者的ILC3频率更高。虽然统计效力有限，但ILC3频率高的患者也显示出生存期缩短的趋势。这些数据将ILC3的存在与AML更差的临床特征联系起来。

本研究首次在AML的骨髓微环境中鉴定出具有促白血病功能的经典ILC3（NKp44+）群体的扩增。研究结果支持一个新颖的工作模型：AML通过分泌AHR配体，以AHR依赖性方式促进ILCP向ILC3分化并导致其扩增。这些在白血病环境下产生的ILC3功能发生改变，高表达GM-CSF和TNFα，进而通过自分泌或旁分泌作用促进AML细胞的增殖、存活和集落形成，在体内加速疾病进展。临床数据进一步证实ILC3与AML患者更高的肿瘤负荷和更差的风险分层相关。讨论部分指出，AML中出现的ILC3在表型和功能上不同于稳态下的ILC3，它们优先产生GM-CSF和TNFα而非典型的IL-17/IL-22，且这种功能调控具有组织特异性。尽管TNFα抑制剂在血液恶性肿瘤中的疗效不一，但靶向上游的AHR/ILC3轴可能提供一种新的治疗策略，通过破坏这种促白血病微环境来抑制疾病进展和复发。此外，ILC3与其他免疫细胞（如T细胞）的相互作用，尤其是在细胞治疗（如CAR-T）背景下，值得未来深入研究。总之，该研究揭示了AML免疫逃逸的一条新途径，即利用AHR-ILC3轴塑造利于自身的微环境，为开发针对ILC3-AML相互作用的新型免疫疗法提供了理论依据。