《Cellular Signalling》：PERK-eIF2alpha-mediated translational inhibition of MCL-1 contributes to potential 2-deoxy-
d-glucose and BAD mimetic combinatorial cancer therapy
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癌细胞依赖糖代谢，2DG作为糖酵解抑制剂通过双重机制诱导凋亡：糖基化干扰导致MCL-1降解，同时BAD去磷酸化解除BCL-xL/BCL-2抑制。PERK-eIF2α通路介导的MCL-1翻译抑制也参与其中。联合BAD BH3模拟物可显著增强抗癌效果。
孙梦宁|李莉|傅荣荣|杨青兰|陈文娟|孙毅|高慧|高航|董娜
中国农业大学动物科学技术学院动物营养与饲料国家重点实验室，北京，中国
摘要
糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2DG）作为一种潜在的治疗剂已被广泛研究，因为肿瘤比正常细胞更依赖有氧糖酵解来获取能量。然而，2DG毒性的确切机制尚未完全明了。在这项研究中，我们证实2DG主要通过干扰糖基化而非糖酵解来诱导细胞凋亡。我们观察到，葡萄糖耗尽或2DG处理会导致MCL-1蛋白水平显著下降。进一步分析表明，2DG的毒性需要MCL-1的降解。此外，通过敲除实验，我们发现BAD是唯一对2DG诱导的细胞凋亡必需的BH3-only蛋白。MCL-1的下调，加上BAD在Serine 155位的去磷酸化，共同导致MCL-1和BCL-xL的抗凋亡功能同时失活，这足以引发2DG的毒性。此外，我们的实验还表明，内质网（ER）应激诱导的PERK-eIF2α通路介导的MCL-1翻译抑制也参与了2DG的毒性作用。基于这些发现，2DG与BAD BH3模拟物的联合使用已被证明对多种类型的癌细胞有效。总之，本研究为2DG和BH3模拟物联合使用作为癌症治疗策略提供了理论基础和依据。
引言
癌细胞严重依赖葡萄糖和有氧糖酵解来获取能量，因此针对葡萄糖代谢的治疗剂可能是选择性消除目标癌细胞的有效策略[1]。在抗糖酵解剂中，2DG作为一种合成的葡萄糖类似物，已被广泛研究作为有前景的抗癌药物，尤其是在与其他治疗剂或放疗联合使用时[2,3]。先前的研究表明，白血病和淋巴瘤细胞对2DG治疗高度敏感[4,5]，并且在临床前模型和早期人体临床试验中，2DG表现出对肿瘤的优先杀伤能力，同时对正常细胞的毒性很小[6]。因此，了解2DG毒性的确切机制对于提高其疗效和开发联合治疗方案至关重要。
在不同模型中的细胞死亡研究显示，BCL-2家族的多个成员（如MCL-1、NOXA [7]和BIM [4]）在葡萄糖代谢抑制过程中调节细胞死亡中起着关键作用。然而，来自多项研究的矛盾证据阻碍了我们对这些机制及其潜在治疗应用的理解。MCL-1是一种众所周知的抗凋亡蛋白，在这一过程中起着核心作用。MCL-1的上调及其稳定性的增强通常与多种血液系统恶性肿瘤相关，并导致血液系统和实体瘤对传统癌症疗法的耐药性[8,9]。因此，MCL-1被广泛认为是癌症治疗的有希望的目标[10]。BH3-only蛋白NOXA几乎只与MCL-1相互作用，而不是与BCL-2、BCL-xL或BCL-w相互作用，从而中和MCL-1的抗凋亡功能。相比之下，BH3-only蛋白BAD与BCL-2亚家族成员紧密结合，但不与MCL-1结合，从而促进细胞凋亡[11]。
在这项研究中，我们证明了葡萄糖耗尽或2DG处理能有效降低MCL-1蛋白水平。进一步的分析表明，PERK-eIF2α介导的翻译抑制参与了MCL-1的下调。由翻译抑制和降解以及BAD的去磷酸化引起的MCL-1下调，对于2DG的细胞毒性是必要且充分的。基于这些发现，我们报告称2DG与BAD模拟物的联合使用是一种非常有效的癌症治疗方法，显著提高了大多数测试癌细胞的敏感性。
部分内容摘录
细胞培养
HEK-293（CVCL_0045）和HeLa（CVCL_0030）细胞在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM，C11965500BT）中培养；小鼠骨髓来源的永生化巨噬细胞（iBMDMs，由美国马萨诸塞大学医学院的K. A. Fitzgerald提供）在其他癌细胞系则在RPMI 1640培养基（11875093）中于37°C、5% CO2条件下培养。所有细胞均在含有10%胎牛血清（FBS）和2 mM GlutaMAX?的培养基中维持。2DG诱导内在细胞凋亡
为了研究2DG诱导的细胞死亡机制（该机制尚未完全阐明），我们在葡萄糖缺乏的培养基中用2DG处理了几种白血病和淋巴瘤细胞系（CCRF-CEM、HL-60、K562和MOLT-4）以及我们实验室常用的HeLa细胞和iBMDMs，以监测细胞凋亡进程。显微镜检查显示，多个细胞系在2DG处理后逐渐失去活力（图S1A）。值得注意的是，iBMDMs表现出最高的敏感性。
讨论
总之，我们的研究表明，2DG触发的线粒体介导的细胞凋亡依赖于MCL-1的同时下调以及BAD去磷酸化对BCL-xL/BCL-2抑制作用的释放（图6C）。这一发现强烈支持了之前关于HCT116细胞中细胞凋亡过程中双重抑制释放的研究[28]。在2DG处理的细胞中，我们观察到质膜的特征性膨胀和破裂。鉴于iBMDMs表达高水平的GSDMD，我们随后敲除了GSDMD基因。
资助
本研究得到了国家自然科学基金（NSFC）的资助（项目编号：92578205）。CRediT作者贡献声明
孙梦宁：验证、项目管理、研究、数据分析。李莉：验证、方法学、研究、数据管理。傅荣荣：验证、研究、数据分析。杨青兰：方法学、研究、数据分析。陈文娟：研究、数据分析。孙毅：验证、数据分析。高慧：验证、研究。高航：验证、方法学。董娜：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、项目协调。致谢
我们感谢中科院纳米生物技术研究所（NIBS）的许多实验室成员，特别是Da Li提供的部分细胞系，以及Huan Zeng、Wei Jiang和Xuyan Shi提供的试剂和流式细胞仪设施及其技术支持。该项目得到了中国农业大学“2115人才发展计划”的资助。
