HIF-1α介导的负反馈环路防止正常发育中TOR信号过度消耗氧气并触发细胞应激

《Nature Communications》：HIF-1α-mediated feedback prevents TOR signalling from depleting oxygen supply and triggering stress during normal development

本研究揭示了正常发育过程中组织生长减速的新机制。研究人员发现，在果蝇翅盘正常发育过程中，即使处于常氧环境，随着组织增大，局部氧气供应逐渐受限，引发缺氧并激活HIF-1α。HIF-1α通过转录激活REDD1抑制TOR信号活性，形成负反馈环路，防止生长过程中氧气过度消耗导致的细胞应激。这项工作阐明了生长自我限制的内在机制，为理解器官大小控制提供了新视角。

　　

在生物体发育过程中，器官生长遵循一个普遍规律：初期快速生长后，生长速度逐渐减缓直至停止。这种S形生长曲线在从哺乳动物到昆虫的多种生物中均有体现，但其背后的分子机制一直不甚明确。在营养充足的情况下，资源限制并非主要原因，而激素信号和形态发生素信号在发育过程中并未减弱，甚至持续增强，因此不能简单解释生长减速现象。理解这一基本生物学过程的内在调控机制，对认识器官大小控制和再生医学具有重要意义。

近日发表在《Nature Communications》上的研究首次揭示，在正常发育过程中，组织自身的生长会通过缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）与TOR信号通路之间的负反馈调节机制，主动限制其生长速度，防止氧气供应过度消耗导致的细胞应激。

研究人员选择果蝇翅盘这一经典模型研究生长控制。通过精确测量第三龄幼虫期（L3）翅盘的体积变化，确认了生长速率确实随发育进程逐渐下降，从L3初期的每小时9%降至末期的每小时2%。随后，他们对不同时间点的翅盘进行转录组分析，发现随着发育进行，与氧化磷酸化（OXPHOS）相关的基因表达逐渐下调，而糖酵解相关基因表达上调，这种代谢转换与缺氧反应相似。

这一发现促使研究团队开发了两种高灵敏度报告系统：FlHypox（基于全长HIF-1α的氧感受器）和SyHREns（基于缺氧反应元件的HIF-1α活性报告基因）。利用这些工具，他们证实了在常氧环境培养的翅盘确实随着发育变得逐渐缺氧，HIF-1α稳定性及其转录活性均随组织生长而增强。

机制研究表明，缺氧激活的HIF-1α通过转录上调REDD1（在果蝇中称为Scylla）来抑制TOR信号通路活性，这与生长减速时期观察到的磷酸化核糖体蛋白S6（pS6）水平下降相一致。令人意外的是，研究还发现TOR信号活性过高会反向诱导缺氧状态，且这种效应在发育晚期（组织较大时）更为显著，表明组织大小/年龄增加了对氧气供应的压力。

进一步实验显示，当HIF-1α被敲低时，即使在没有其他遗传干预的情况下，也会导致c-Jun N-末端激酶（JNK）信号通路激活，表明出现细胞应激。这种应激在同时过表达Rheb（TOR激活剂）时更为严重，而抑制TOR活性或适度提高环境氧浓度（22.5% O₂）可缓解这种应激。HIF-1α突变体果蝇出现翅膀皱缩和刚毛密度降低等表型，而雷帕霉素处理可部分挽救这些缺陷，证明HIF-1α通过抑制TOR活性防止氧气供需失衡引起的细胞损伤。

本研究主要采用了以下关键技术方法：利用果蝇翅盘发育模型进行体积测量和生长速率计算；通过转录组测序分析基因表达动态变化；开发高灵敏度的HIF-1α稳定性（FlHypox）和活性（SyHREns）报告系统；使用Hypoxyprobe?检测组织缺氧程度；通过区室特异性遗传操作（hh-GAL4系统）进行功能获得和缺失研究；利用JNK信号报告基因（TRE-NLS4xNG）评估细胞应激；以及通过CRISPR-Cas9技术生成HIF-1α条件性突变体。

转录组分析提示L3翅盘有氧代谢逐渐减少

对精确计时的L3翅盘体积测量显示，相对生长速率在L3期间逐渐下降。RNA-Seq分析发现，与生长速率正相关的基因中，包括DNA、RNA和蛋白质合成相关基因（第I组）以及氧化磷酸化、三羧酸循环和乙酰辅酶A生物合成相关基因（第II组）的表达随时间推移而下降。同时，糖酵解相关基因和葡萄糖转运体1（Glut1）表达显著上调，提示代谢从有氧呼吸向糖酵解转变。

发育中的L3翅盘在环境常氧下逐渐缺氧

研究人员开发了FlHypox感受器，包含全长HIF-1α，通过V5和mNeonGreen双标记，并突变其HIF-1β二聚化域以防止激活下游基因。实验表明，FlHypox在5%氧浓度下1小时内信号增强，而突变型FlHypoxP850A（P850A）在常氧和缺氧下均保持稳定。利用这一工具，发现L3期间翅盘内FlHypox信号逐渐增强，而FlHypoxP850A信号有所下降，表明缺氧程度随发育增加。Hypoxyprobe?检测和SyHREns报告基因活性分析均证实了这一点。

HIF-1α通过激活REDD1抑制TOR信号

研究发现，REDD1表达在L3期间增加约5倍，与TOR信号活性下降同步。HIF-1α或REDD1敲低导致pS6水平升高，而过表达HIF-1α则抑制S6磷酸化。HIF-1α过表达显著增加REDD1转录本，REDD1敲低导致翅膀增大12%，表明HIF-1α通过转录激活REDD1抑制TOR活性。

过度TOR活性以组织大小依赖的方式导致缺氧

Rheb过表达增强SyHREns活性，表明TOR信号促进HIF-1α活性。通过比较FlHypox和FlHypoxP850A对Rheb过表达的反应，证实TOR活性确实引起缺氧。此外，Rheb过表达对SyHREns活性的影响在L3晚期比中期更显著，表明组织年龄/大小增加了对氧气供应的压力。

过度TOR活性在缺乏HIF-1α时导致细胞应激

HIF-1α敲低激活JNK信号，与Rheb过表达协同增强应激反应。HIF-1α敲低引起的轻度应激可通过抑制TOR活性完全挽救。HIF-1α突变体翅膀皱缩表型可被雷帕霉素部分挽救，提高氧浓度（22.5%）可缓解Rheb诱导的应激，而轻度低氧加剧该应激，表明TOR诱导的细胞应激源于氧气供需不匹配。

本研究揭示了一个精妙的负反馈调节机制：在正常发育过程中，组织生长通过TOR信号促进代谢和生物合成，增加氧气消耗，导致局部缺氧；缺氧激活HIF-1α，进而通过上调REDD1抑制TOR活性，防止氧气过度消耗和细胞应激。这一机制如同"生物恒温器"，确保生长过程中的氧气消耗不超过供应能力，可能是器官生长自我限制的重要内在机制。

这一发现不仅解释了发育中生长减速现象，也为理解相关病理过程提供了新视角。在肿瘤等快速生长组织中，可能存在类似的氧气供需失衡机制。研究揭示的HIF-1α-TOR反馈环路为相关疾病治疗提供了潜在靶点。此外，开发的高灵敏度缺氧报告系统为未来研究氧气生物学提供了有力工具。

该研究由英国弗朗西斯·克里克研究所的Yifan Zhao、Cyrille Alexandre、Gavin Kelly、Jean-Paul Vincent和Gantas Perez-Mockus合作完成，核心资助来自弗朗西斯·克里克研究所、英国癌症研究中心、英国医学研究理事会和威康信托基金会。