脊椎动物运动纤毛极端末梢的蛋白质复合体调控其组织结构、长度与功能

《Nature Communications》：A protein complex in the extreme distal tip of vertebrate motile cilia controls their organization, length, and function

本研究聚焦于脊椎动物多纤毛细胞运动纤毛末梢结构不清的问题，研究人员通过蛋白质组学与高分辨率显微技术，发现由Ccdc78和Ccdc33构成的蛋白复合体定位于纤毛极端末梢（EDT），该复合体具有微管捆绑活性，对维持纤毛末梢结构域（如Spef1标记区）、调控9+2纤毛长度以及协调纤毛搏动和流体流动至关重要，为原发性纤毛运动障碍（PCD）的病因提供了新的潜在机制。

　　

在我们的身体里，无数微小的“毛发”——也就是纤毛，在默默地工作着。它们存在于我们的呼吸道、大脑和生殖道等部位，通过协调一致的摆动，负责清除黏液、推动脑脊液流动以及运输配子等重要生理功能。这些功能主要由多纤毛细胞（MCC）上的运动纤毛完成。如果纤毛摆动失灵，就会导致一种名为原发性纤毛运动障碍（PCD）的遗传性疾病，患者常遭受慢性呼吸道感染、不孕甚至脑积水等困扰。

虽然科学家们对纤毛基体和轴丝的结构功能已有较多了解，但纤毛最末端的精细结构和分子组成却一直是个谜团。这个被称为“末端”的区域在不同物种、不同组织甚至不同发育阶段都存在巨大差异，这种可变性使得研究变得异常困难。然而，有理由相信，这个承受着纤毛摆动时巨大机械应力的末端区域，对于纤毛的稳定性、长度控制以及正常功能至关重要。解开纤毛末端的分子构成和功能，对于理解纤毛生物学和相关疾病具有深远意义。

正是在此背景下，由Juyeon Hong、Chanjae Lee和John B. Wallingford等领导的研究团队在《Nature Communications》上发表了他们的最新发现。他们综合利用非洲爪蟾、小鼠和人类的多纤毛细胞模型，结合高分辨率显微镜技术和蛋白质组学分析，揭示了一个位于运动纤毛最末端的关键蛋白质复合体，并深入探究了其在纤毛组织、长度和功能调控中的核心作用。

为开展此项研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术：利用CRISPR/Cas9技术或吗啉寡核苷酸在非洲爪蟾胚胎中进行基因敲低，并在小鼠和人类气道细胞中进行验证；通过免疫沉淀结合质谱分析（AP-MS）筛选蛋白质相互作用；采用共聚焦显微镜和结构光照明显微镜（SIM）进行蛋白质定位和超微结构观察；借助负染透射电子显微镜（TEM）观察纤毛末梢形态；通过体外微管聚合和捆绑实验分析蛋白质功能；利用高速 spinning disk 共聚焦显微镜记录纤毛搏动，并结合Flowtrace和粒子图像测速技术（PIV）定量分析流体流动。

Ccdc78定义MCC运动纤毛极端末梢的一个独特结构域

研究人员首先发现，一个功能未知的蛋白Ccdc78特异性地定位于非洲爪蟾、小鼠和人类MCC运动纤毛的最末端。通过高分辨率成像，他们观察到Ccdc78标记的区域是一个极其狭小的区域（<0.2微米），而之前已知的末端蛋白Spef1则标记一个更长的区域（约2.25微米）。电子显微镜结果进一步证实，纤毛最末端存在一个球状结构（“灯泡”），其大小和位置与Ccdc78标记区完美吻合，而Spef1则标记其近端的“颈部”区域，该区域被证实是中央微管的延伸。其他末端标记蛋白（如Cep104, Eb3）的定位模式也支持了这一结构模型。因此，研究者提出了“极端末梢”（EDT）这一新概念，特指由Ccdc78占据的纤毛最顶端区域。

Ccdc78为纤毛末端蛋白的正确定位所必需

为了探究Ccdc78的功能，研究人员在爪蟾胚胎中敲低了Ccdc78。结果发现，不仅Ccdc78本身从末端消失，Spef1的末端富集也完全丧失。更值得注意的是，其他末端蛋白的定位发生了剧烈改变：Cep104和Eb3原本在末端和近端（约2.2微米处）的两个信号峰合并为一个位于最末端的单峰；而正常情况下位于近端（标志外周微管B-tubule末端）的Armc9，在敲低后也异常地定位到了纤毛的最尖端。这些结果表明，缺失Ccdc78导致整个末梢结构域（特别是中央微管延伸部分）崩溃，使得所有微管似乎终止于同一点。

Ccdc78与Ccdc33在纤毛末端发生物理和功能相互作用

通过亲和纯化质谱分析（AP-MS），研究人员发现Ccdc78与另一个功能未知的蛋白Ccdc33存在强烈相互作用，并且这一相互作用在纤毛轴丝内特异性发生。与Ccdc78类似，Ccdc33也特异性地定位于纤毛的极端末梢（EDT）。功能上，Ccdc78的缺失会导致Ccdc33完全无法定位到末端，而Ccdc33的缺失则部分削弱了Ccdc78的末端定位。Ccdc33的敲低也引起了与Ccdc78敲低相似但程度较轻的末端蛋白定位紊乱和纤毛结构破坏。然而，与Ccdc78不同，Ccdc33的敲低不影响基体数量，说明Ccdc33的功能特异性地体现在纤毛末端。

Ccdc78和Ccdc33在体内外均显示微管捆绑活性

鉴于Spef1已知具有微管捆绑功能，研究人员推测Ccdc78和Ccdc33可能具有类似活性。通过在爪蟾表皮细胞中进行镶嵌表达，他们发现过量表达Ccdc78或Ccdc33都能引起细胞内微管发生显著的成束现象。体外实验进一步证实，将纯化的Ccdc78或Ccdc33蛋白与聚合的微管共孵育，能有效促使微管形成粗大的束状结构。更重要的是，较低浓度的Ccdc78和Ccdc33共同作用时，也能达到与高浓度单蛋白相似的捆绑效果。这表明Ccdc78和Ccdc33具有微管捆绑活性，并且可能协同作用以稳定纤毛末端结构。

Ccdc78和Ccdc33特异性调控9+2运动纤毛的长度

功能缺失实验表明，Ccdc78和Ccdc33对于维持MCC纤毛的正常长度至关重要。Ccdc78敲低导致纤毛长度均匀且严重地缩短了约8微米（约57%）。Ccdc33敲低也导致纤毛显著缩短约6微米，但表型更具异质性，即同一细胞上的纤毛长短不一。这种缩短不能单纯用末端结构域（Spef1区域，约2微米）的缺失来解释，暗示其可能影响了整个轴丝的稳定性或组装。有趣的是，在缺乏中央微管对的9+0运动纤毛（如非洲爪蟾左右组织器中的纤毛）中，Ccdc78和Ccdc33并不富集于末端，并且敲低它们对这类纤毛的长度没有影响。这说明Ccdc78/Ccdc33复合体的功能是针对具有中央微管对的9+2运动纤毛的。

Ccdc78和Ccdc33通过不同机制控制纤毛长度

研究人员观察到，Ccdc33敲低后纤毛长度的异质性与Ccdc78在末端定位的残留量有关：残留Ccdc78信号强的纤毛更长，反之则更短。Spef1信号域的长度也与纤毛总长呈正相关。然而，单纯过表达Ccdc78并不能使纤毛过度伸长，也无法挽救Ccdc33敲低导致的表型。对蛋白结构的分析发现，Ccdc33含有脂质结合的C2结构域，而删除这些结构域会完全废除Ccdc33的救援能力。这些数据表明，Ccdc33通过其C2结构域（可能用于锚定纤毛膜）来有效招募并稳定Ccdc78于末端，从而协同控制纤毛长度。

Ccdc78和Ccdc33的缺失引发不同的纤毛搏动和流体流动缺陷

对纤毛搏动的观察揭示了更深入的功能差异。尽管长度均匀缩短，Ccdc78敲低细胞的纤毛仍能维持正常的异时性搏动波。相反，Ccdc33敲低细胞的纤毛搏动出现明显异常，在一些细胞中纤毛显得僵硬且异时性完全消失，在另一些细胞中异时性仅存在于局部区域。对纤毛产生的流体流动进行定量分析发现，Ccdc78敲低导致靠近表皮区域的流动速度下降约50%，而远表皮的微弱流动则基本消失。Ccdc33敲低的影响则更为严重，靠近表皮的协调流动速度下降了约90%，几乎完全丧失了产生有效流体流动的能力。这表明，纤毛长度的均一性对于维持协调的异时性搏动和有效的流体推动至关重要。

本研究首次清晰地定义了脊椎动物运动纤毛极端末梢（EDT）这一关键结构域，并鉴定出Ccdc78和Ccdc33是构成该结构域的核心功能模块。该复合体通过其微管捆绑活性，协同稳定纤毛末梢架构，这对于确保其他末端蛋白的正确定位、维持9+2运动纤毛的正常长度、协调纤毛搏动以及产生有效的生理性流体流动都是不可或缺的。值得注意的是，Ccdc78和Ccdc33在功能上并非冗余，它们通过不同的机制影响纤毛，其中Ccdc33在维持纤毛长度均一性方面扮演着更为关键的角色，这可能与其所含的C2结构域介导的膜锚定功能有关。

该研究的意义重大。首先，它极大地深化了我们对纤毛，特别是其易被忽视的末梢结构的分子层次的理解。其次，研究揭示了纤毛末梢结构、长度控制、搏动动力学和最终生理功能之间的内在联系。最后，由于许多原发性纤毛运动障碍（PCD）患者表现出正常的纤毛超微结构，病因不明，本研究提示Ccdc78和Ccdc33等末端结构蛋白的缺陷可能是导致此类疾病的新病因，为未来的疾病诊断和治疗提供了新的候选基因和分子靶点。