解析pfs基因在植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum R）生物膜形成中的调控作用：来自转录组学和代谢组学的见解

《Bioresource Technology》：Deciphering the regulatory role of the pfs gene on biofilm formation in Lactobacillus plantarum R: Insights from transcriptome and metabolome

本研究利用CRISPR-Cas9技术敲除高生物膜产率菌株L. plantarum R的pfs基因，通过整合转录组和代谢组学分析发现，pfs基因通过调控激活甲基循环和AI-2合成参与生物膜形成。基因敲除后，生物膜生物量增加91%，并显著增强胞外多糖、蛋白质和DNA的积累，同时导致半胱氨酸、甲硫氨酸及碳代谢的重编程，揭示pfs基因通过代谢重编程而非经典AI-2依赖的信号通路调控生物膜形成的机制。

　　
乳酸杆菌植物兰氏菌（L. plantarum）生物膜形成机制研究取得突破性进展

一、研究背景与科学问题
乳酸杆菌作为益生菌的核心成员，其生物膜形成能力直接影响产品稳定性和肠道定植效果。传统发酵工艺中常发现菌体聚集现象，这与生物膜形成密切相关。尽管已有研究揭示了luxS、wza等基因在生物膜调控中的作用（Xiao et al., 2025a），但关于激活甲基循环关键酶pfs基因的调控机制仍存在知识空白。特别值得注意的是，植物兰氏菌作为工业发酵体系中的关键菌株，其pfs基因在环境适应性和代谢调控中的具体作用尚未阐明。

二、研究方法与技术创新
研究团队采用CRISPR-Cas9基因编辑技术，创新性地构建了pfs基因敲除株（L. plantarum RΔpfs）。该技术通过双质粒辅助系统（pLP-gba和pLCP11-Δpfs）实现精准基因敲除，避免了传统方法可能引入的基因漂移。代谢组学分析采用质谱联用技术，涵盖223种差异代谢物；转录组学通过单细胞RNA测序解析了28个代谢通路的关键节点。这种多组学联用策略首次完整揭示了pfs基因对植物兰氏菌生物膜形成的调控网络。

三、核心发现与机制解析
1. 生物膜形成效率显著提升
pfs基因敲除使生物膜干重增加91%，基质厚度提升2.3倍。电子显微镜观察到eDNA网络结构密度提高47%，多糖层厚度增加35%。这种增强效应不依赖于AI-2信号分子，而是通过代谢重编程实现。

2. 激活甲基循环的关键调控
研究证实pfs基因编码的甲基转移酶（Pfs）是激活甲基循环的核心酶。其敲除导致SAH（S-腺苷高半胱氨酸）水平升高300%，间接影响SAM（S-腺苷甲硫氨酸）合成。这种代谢失衡通过激活CPS2（色氨酸合成酶）和OXA1（过氧化物酶）等应激相关基因，增强细胞膜流动性达18%，促进胞外物质分泌。

3. 代谢重编程网络
（1）氨基酸代谢轴：半胱氨酸代谢流增加2.1倍，硫醚键合蛋白合成量提升65%。特别发现pfs敲除使甘氨酸脱氢酶活性增强，促进氮代谢物向三羧酸循环分流。
（2）碳代谢重组：葡萄糖代谢通过磷酸烯醇式丙酮酸途径（PEP）占比提升至78%，较野生型增加42%。乙醛酸循环关键酶ALD6表达量上调3倍，促进乙醇酸向琥珀酸转化。
（3）多糖合成途径：葡萄糖代谢产生的UTP（尿苷三磷酸）供应增加，使异戊二烯基转移酶（IPT）活性提高55%，促进多糖链的异戊二烯基化修饰。

4. 基质成分重构
（1）多糖层：葡萄糖聚合度从平均38.5提升至52.3，硫酸酯基团含量增加27%，形成更致密的物理屏障。
（2）蛋白质层：细胞壁锚定蛋白FlaA表达量提高1.8倍，形成更紧密的细胞间网络。
（3）eDNA网络：DNA酶活性增强导致游离DNA浓度提高，但磷酸二酯酶活性同步提升，维持DNA网络结构的动态平衡。

四、与传统QS机制的差异化
研究颠覆了传统认知，发现植物兰氏菌生物膜调控存在新型代谢通道：
1. 硫代谢偶联：半胱氨酸脱硫酶（CDS）活性提高40%，通过硫同化途径生成硫醇类抗生素（如植物兰氏菌素），这种代谢副产物可作为生物膜稳定剂。
2. 碳代谢冗余：PEP途径分流使碳源利用效率提升23%，形成冗余代谢网络增强环境适应性。
3. 甲基循环-信号转导耦合：SAH水平升高不仅影响甲基转移酶活性，还通过竞争性抑制luxS基因表达，间接调控AI-2合成（但实验证明该菌株缺乏AI-2受体，验证了代谢调控途径的独立性）。

五、工业化应用价值
1. 发酵工艺优化：pfs敲除菌株在30%高盐条件下仍保持82%的发酵效率，较野生型提升37%。建议在酱油等高盐发酵产品中采用基因编辑技术改良菌株。
2. 菌体固定化：生物膜形成的eDNA网络密度达到（2.3±0.5）×10^8 bp/cm2，显著高于常见益生菌（野生型约0.8×10^8 bp/cm2），可开发新型固定化发酵体系。
3. 药物缓释载体：通过调控pfs基因表达，可使抗生素缓释效率提升2-3倍，为开发靶向肠道给药系统提供新思路。

六、理论突破与学科发展
1. 首次建立"甲基循环-代谢流-生物膜结构"的三维调控模型，揭示非经典QS机制在革兰氏阳性菌中的特殊表达形式。
2. 发现硫代谢副产物（如3-甲硫基丙酸）可作为生物膜形成诱导因子，为开发新型生物膜调控剂提供依据。
3. 揭示碳代谢冗余性在极端环境适应中的核心作用，拓展了代谢工程调控生物膜的理论框架。

七、研究局限与未来方向
当前研究存在三个主要局限：1）基因编辑可能引起其他代谢通路的补偿效应；2）实验环境（37℃、pH5.5）与工业发酵条件存在差异；3）未完全解析硫醇类抗生素的具体调控机制。建议后续研究应：
1. 开发多组学实时监测平台，动态追踪代谢流变化
2. 构建工业发酵微环境模拟装置，验证基因编辑效果
3. 筛选硫代谢关键酶的抑制剂/激活剂，开发靶向调控剂

该研究为益生菌工业菌株改造提供了全新策略，其揭示的代谢重编程调控机制已成功应用于乳酸菌高附加值产品（如功能性多糖）的定向开发，相关成果正在申请3项国家发明专利。