发育期多氯联苯混合物暴露诱导成年大鼠子代选择性神经改变：一项免疫组织化学研究

《Journal of Developmental Origins of Health and Disease》：Developmental polychlorinated biphenyl mixture exposure promotes selective neural alterations: An immunohistochemical study in adult rat offspring

本文推荐：为探究发育期暴露于环境相关剂量多氯联苯（PCBs）的长期中枢神经系统（CNS）效应，研究人员开展了一项针对成年大鼠子代的免疫组织化学研究。结果揭示，发育期PCB暴露可显著改变小脑蚓部GAD67（谷氨酸脱羧酶-67）免疫反应性、蓝斑（LC）脂褐素自发荧光等多个脑区标志物，支持“健康与疾病的发育起源”（DOHaD）概念，表明生命早期环境扰动可对成年期健康轨迹产生持久影响。

　　

在我们赖以生存的地球上，多氯联苯（PCBs）这类持久性有机污染物（POPs）如同看不见的幽灵，早已通过大气远距离传输和食物链生物放大作用遍布全球，甚至在遥远的加拿大北极地区也留下了高浓度的足迹。对于生活在这些地区的因纽特人等原住民群体而言，通过食用鱼类和高等动物而摄入PCBs，使得胎儿和新生儿面临着尤为严峻的健康威胁。尽管环境中PCB的污染水平有所下降，但发育早期（包括子宫内和哺乳期）暴露于PCBs，仍与妊娠期缩短、胎儿生长受限以及未来出现认知问题等风险密切相关。一个核心的科学问题随之浮现：生命早期这种低剂量、长期的环境污染物暴露，究竟会对个体中枢神经系统的结构和功能产生怎样深远而持久的影响？这背后契合了“健康与疾病的发育起源”（DOHaD）这一重要概念，即生命早期的环境扰动可能塑造个体一生的健康轨迹。

为了回答这个问题，由Nazneen Rustom和James Reynolds领导的研究团队在《Journal of Developmental Origins of Health and Disease》上发表了一项深入研究。他们设计了一个模拟人类暴露环境的动物实验：让怀孕的Sprague Dawley大鼠在整个妊娠期和哺乳期（共42天）每日摄入含有14种PCB混合物的饼干，设置的剂量（低剂量0.011 mg/kg/天和高剂量1.10 mg/kg/天）参考了加拿大北极地区人群流行病学调查中发现的水平。研究人员随后将这些大鼠的子代饲养至成年后期（出生后450天），此时雌性子代已处于生殖衰老期。然后，他们运用了一套全面的免疫组织化学和免疫荧光标记物“组合拳”，对这些成年子代大鼠的脑组织进行了精细的检测，旨在评估发育期PCB暴露是否会导致大脑结构和功能的长久改变。这些标记物覆盖了神经传递（如GAD67、酪氨酸羟化酶TH）、氧化应激（如脂褐素、Cleaved caspase-3）、神经血管单元（如RECA-1）以及小胶质细胞活化（Cd11b）等多个方面。

本研究的关键技术方法主要包括：通过孕期和哺乳期喂食含PCB混合物饼干的体内暴露模型；在子代成年期（PND 450）进行经心脏灌注取脑、固定、冷冻和切片（40μm）；应用多种免疫组织化学（IHC，如DAB显色）和免疫荧光（IF）技术检测特定蛋白标志物（如GAD67, TH, RECA-1, Cd11b, Cleaved caspase-3等）以及脂褐素自发荧光、尼氏染色（Cresyl violet）和Hoechst核染色；并采用Zeiss显微镜进行图像采集，使用ImageJ软件对多个脑区的染色结果进行半定量或形态学分析。样本来源于Sprague Dawley大鼠子代。

研究结果

GAD67免疫反应性

在小脑蚓部，双向方差分析显示处理因素对GAD67免疫反应性有显著主效应。Sidák事后检验表明，与对照组相比，低剂量和高剂量PCB暴露均显著增加了小脑蚓部的GAD67免疫反应性，且高剂量组的效果强于低剂量组，呈现出剂量反应关系。这表明发育期PCB暴露增强了成年子代小脑的抑制性神经传递。

脂褐素自发荧光

在蓝斑（LC），双向方差分析显示处理因素对脂褐素自发荧光有显著主效应。事后检验发现，与对照组相比，低剂量和高剂量PCB暴露均显著降低了LC中的脂褐素自发荧光。在背侧纹状体，低剂量PCB暴露也显著降低了脂褐素自发荧光，而高剂量组与对照组无显著差异。脂褐素的减少通常不被直接解释为氧化应激加剧，在某些情况下甚至可能与细胞健康改善有关。

RECA-1（内皮细胞标记）

在导水管周围灰质（PAG） 和腹侧眶额叶皮层，双向方差分析均显示处理因素对RECA-1免疫反应性（反映内皮细胞和毛细血管周长）有显著主效应。事后检验发现，与对照组相比，低剂量PCB暴露显著减小了这两个脑区的内皮细胞/毛细血管周长，提示PCB暴露可能导致血脑屏障功能或血管结构的长期改变。高剂量暴露组与对照组无显著差异。

p<0.001) decreased the perimeter of endothelial cells and capillaries in the PAG in adult rat offspring, in comparison to controls(high dose PCB,p=0.875). Data are presented as mean±SEM of RECA-1 immunoreactivity(pixels)in the PAG of control(n=8,4 male,4 female) and PCB-exposed(low PCB(0.011 mg/kg/day):n=7,3 male,4 female;high PCB(1.10 mg/kg/day),n=8,4 male,4 female) adult rat offspring(postnatal day 450)(p=<0.05).(b) Photomicrographs(ba: control; bb: low PCB; bc: high PCB) of RECA-1 in the PAG(bregma~-6.30--7.04 mm). Endothelial cells are abundant, dark in appearance and elongated in control tissue(HRP-conjugated streptavidin). In offspring exposed to PCBs in development,RECA-1 immunoreactivity is decreased with fewer elongated cells and reduced endothelial cell thickness and capillary definition, particularly following the low dose exposure. Images were captured at 10X magnification.Scale bar represents 75μm.Cornal section containing PAG(region-of-interest identified in black) is presented under the scale bar of the photomicrograph.'>

p=0.016) decreased the perimeter of endothelial cells and capillaries in the ventral orbitofrontal cortex in adult rat offspring,in comparison to controls(high dose PCB,p=0.183).Data were transformed(log10) and are presented as mean±SEM of RECA-1 immunoreactivity(pixels) in the ventral orbitofrontal cortex of control(n=8,4 male,4 female) and PCB-exposed(low PCB(0.011 mg/kg/day):n=8,4 male,4 female; high PCB(1.10 mg/kg/day),n=8,4 male,4 female) adult rat offspring(postnatal day 450)(p=<0.05).(b) Photomicrographs(ba: control;bb:low PCB;bc:high male,4 female; high PCB(1.10 mg/kg/day),n=8,4 male,4 female) adult rat offspring(postnatal day 450)(*p=<0.05).(b) Photomicrographs(ba: control;bb:low PCB;bc:high images to aid visualization of endothelial cells and capillaries. Scale bar represents 75μm. Coronal section presented under the scale bar depicts the capture field of photomicrographs are within the ventral orbitofrontal cortex(identified in black).'>

非单调剂量反应关系

本研究观察到一些非单调剂量反应关系的迹象。例如，在背侧纹状体的脂褐素、PAG和腹侧眶额叶皮层的RECA-1等指标上，低剂量PCB暴露产生了显著效应，而高剂量暴露的效应反而减弱或不显著。这种现象在内分泌干扰物如PCBs的研究中并非罕见，提示低剂量暴露的效应不能简单地根据高剂量暴露的结果来预测。

研究结论与意义

本研究通过系统性的免疫组织化学分析，有力地证明了发育期（孕期和哺乳期）暴露于环境相关剂量的PCB混合物，能够在成年子代大鼠的中枢神经系统中引发脑区特异性和标志物选择性的长期改变。这些改变涉及抑制性神经传递（小脑GAD67增加）、氧化应激标志物（脂褐素在多个脑区减少）以及神经血管单元（内皮细胞形态改变）等多个方面。

研究结果显著支持了“健康与疾病的发育起源”（DOHaD）学说，强调了生命早期环境因素对远期神经系统健康的编程作用。特别值得注意的是，某些效应表现出非单调剂量反应关系，这警示我们在评估环境污染物（尤其是内分泌干扰物）的低剂量健康风险时，需要格外谨慎。本研究首次报道了发育期PCB暴露对成年期蓝斑脂褐素和导水管周围灰质血管内皮的长期影响，为理解PCBs的神经毒性机制提供了新的视角。所发现的易感脑区（如小脑、蓝斑、眶额叶皮层、纹状体等）的功能与既往流行病学研究中发现的与PCB暴露相关的神经行为缺陷（如认知灵活性问题、注意力不集中、冲动控制受损等）存在潜在关联，为进一步探索PCB神经毒性的机制及其与行为表型的联系奠定了基础。总之，这项工作深化了我们对发育期环境污染物暴露如何潜在地影响大脑老化和神经系统疾病易感性的认识，对公共卫生政策制定和风险评价具有重要的启示意义。