阐明含有赖氨酸富集三肽序列的脂肽中的β-折叠片排列方式：纤维结构与纳米带结构

《The Journal of Physical Chemistry B》：Elucidating β-Sheet Ordering in Lipopeptides Bearing Lysine-Rich Tripeptide Sequences: Fibrils versus Nanotapes

两性离子肽在不同pH条件下的自组装行为通过原子动力学模拟（MD）、分子理论（MOLT）及实验方法（SAXS、FTIR）综合研究。结果表明，C16-XKK（X=W/Y）在pH>8时形成β-折叠纤维，而C16-KXK（X=W/Y）在pH 2–12稳定形成层状纳米带，差异源于芳香残基（W/Y）的π-π堆积和氢键能力。MOLT成功预测高pH形态，但低估低pH协同氢键，导致对C16-KXK形态预测偏差。MD揭示了C16-XKK的β-折叠更稳定，且纤维核心富集芳香残基，而纳米带结构因π-π堆积更致密。氢键数量与芳香残基种类相关，酪氨酸（Y）因羟基形成更多氢键。本研究为理性设计纳米结构肽提供了理论依据。

　　
脂肽自组装行为的多尺度模拟与实验验证研究

本项研究系统考察了C16-KWK/K16-WKK和C16-KYK/K16-YKK四组阳离子脂肽在不同pH条件下的自组装行为，揭示了氨基酸序列和电荷状态对纳米结构形成的决定性影响。通过结合实验表征（SAXS、FTIR）与计算模拟（MOLT理论模型、原子力场分子动力学），建立了从分子构象到集体形态的多尺度研究体系。

在实验方法方面，研究者采用小角X射线散射（SAXS）和红外光谱（FTIR）对脂肽自组装体的形态进行原位检测。特别设计的MD模拟方法克服了传统模拟中几何约束的局限性，通过先构建具有稳定氢键的β折叠层，再扩展为256分子的纤维束或双层纳米带，成功模拟了脂肽自组装的关键构型。这种建模策略结合了文献报道的参数优化方法，确保了模拟结果与实验数据的可比性。

SAXS结果揭示了四种脂肽不同的自组装模式：C16-WKK和C16-YKK在高pH（8）下形成半径分别为13.6和16.5?的圆柱状纤维束，表现出典型的纤维形态学特征（I∝q?1的散射强度衰减规律）。而C16-KWK和C16-KYK在pH范围2-12内持续形成厚度24-27?的层状纳米带，其低q散射行为符合二维有序结构的特征（I∝q?2衰减）。

FTIR光谱进一步证实了β折叠结构的形成差异。C16-XKK（X=W/Y）的1650-1620cm?1区域出现特征峰，表明存在稳定的β折叠构象。而C16-KXK（X=W/K）的谱图中该区域吸收较弱，显示分子构象更倾向于无规卷曲。特别值得注意的是，酪氨酸（Y）的酚羟基在pH>8时形成更多氢键，导致其纤维束结构比色氨酸（W）同类结构更稳定（ΔG=-144kJ/mol·nm3 vs -153kJ/mol·nm3）。

分子动力学模拟揭示了关键结构特征：C16-WKK和C16-YKK纤维束中，氨基酸侧链通过π-π堆积和氢键形成稳定的平行β折叠层（图8a,b,d,g）。每个纤维束包含约144个脂肽分子，沿轴向周期性排列，形成半径约13-16?的空芯圆柱体。相比之下，C16-KWK和C16-KYK的层状纳米带结构中，亲脂性碳链层（厚度约5-7?）通过疏水作用紧密堆积，而带正电的氨基酸残基（K、Y）则形成横向交联的β折叠层（图8e,j）。这种差异导致两种体系具有截然不同的形态稳定性。

理论模型MOLT在预测高pH形态时表现优异，准确区分了W/Y取代的纤维束与K取代的层状结构。然而在低pH条件下，MOLT低估了氢键的协同效应，错误预测K取代体系会形成囊泡（图4）。这表明对于亲水性氨基酸（如Y的酚羟基），需要考虑溶剂化效应和电荷调节对自组装的影响。实验数据证实，C16-KXK体系在pH<8时仍保持层状结构，其主链间距约3.5?，符合单层脂膜厚度参数。

氢键网络分析显示，C16-YKK和C16-WKK纤维束中每个分子平均形成1.5-1.8个氢键，而层状结构体系（C16-KXK）的氢键数量相对稳定。值得注意的是，Y的酚羟基在pH>8时能形成额外的氢键网络，这可能是其纤维束结构更稳定（自由能密度低12%）的关键因素。相反，W的吲哚环在纤维束中主要参与π-π堆积，而非氢键形成。

分子动力学模拟发现，C16-YKK纤维束中存在独特的"苯环-碳链"堆积模式（图11b），每个Y残基的邻位（距离0.35-0.5nm）有2.3±0.5个其他芳香环，而W取代体系该数值仅为1.1±0.3。这种差异导致Y取代体系纤维束的刚性（弹性模量约5.2kJ/m2）显著高于W取代体系（3.8kJ/m2）。

实验与模拟的协同验证揭示了pH调控机制：当pH>8时，Y的酚羟基去质子化形成负电荷，与两个K残基的正电荷形成稳定的三明治结构。而W的吲哚环在pH>9时发生质子化，导致相邻纤维束段间静电排斥增强，促进纤维束的轴向排列。这种电荷-氢键协同作用解释了为何XKK体系（X=W/Y）在pH>8时形成纤维束，而KXK体系（X=W/K）则形成层状结构。

本研究的创新性在于首次将MOLT理论模型与原子力场分子动力学结合，建立从分子构象到集体形态的完整预测体系。MOLT理论通过蒙特卡洛模拟生成大量分子构象，再结合自由能最小化计算，成功预测了高pH条件下纤维束与层状结构的形态差异。原子动力学模拟则揭示了层状结构中特有的"螺旋折叠"构象（图9），其中K残基的氨基形成分子内氢键，而W的吲哚环则通过疏水作用排列在碳链层的外表面。

研究还发现，两种纤维束体系在构象熵方面存在显著差异。C16-YKK纤维束的构象熵（-5.2 kcal/mol）比C16-WKK（-3.8 kcal/mol）更低，表明Y取代体系具有更强的构象刚性。这种熵变差异与纤维束的机械强度（弯曲刚度比值为1.7:1）和生物相容性（细胞膜穿透效率差异达3倍）密切相关。

未来研究方向包括：1）建立基于机器学习的分子构象生成模型，加速复杂体系的模拟；2）开发新型脂肽材料，利用Y的酚羟基形成pH响应型纤维束；3）研究多层纤维束的组装机制，探索其在药物递送系统中的应用潜力。该研究为设计功能化脂肽纳米材料提供了理论依据，特别是在抗纤维化治疗和靶向给药系统开发方面具有潜在应用价值。