微波辅助的硫酯催化工具包，用于模块化糖肽的合成

《JACS Au》：Microwave-Assisted Thioester-Empowered Toolkit for Modular Glycopeptide Synthesis

糖肽高效合成新方法MateGPT研究。该法采用硫酯基化糖氨基酸为原料，通过AgSbF6活化、Oxyma辅助和微波加热（50℃/10min），实现糖肽的快速（10分钟）高效（1当量试剂）固态合成，适用于复杂糖链（如O-曼nosyl、S- thioglycoside、N-甘露糖酰）和刚性肽段（丙氨酸、支链氨基酸）的连接。该方法保持立体选择性和避免异构化，可自动化操作，并与酶法糖基化修饰兼容，成功制备含多糖链的α- dystroglycan和Notch-1受体EGF12域糖蛋白。该平台为功能糖生物学和生物医学应用提供了模块化、经济高效的糖肽合成策略。

　　
该研究系统性地开发了微波辅助硫酯化氨基糖酸介导的 glycopeptide 工程化合成新范式（MateGPT），通过整合化学合成与酶催化技术，显著提升了复杂糖基化生物分子的可及性。该技术突破传统糖基化合成的三大瓶颈：首先，利用硫酯化修饰实现糖基载体的稳定化与模块化，解决了糖苷键化学活性和空间位阻的矛盾；其次，创新性采用AgSbF6活化体系与Oxyma添加剂协同作用，在50℃微波场中10分钟完成糖基-肽链的高效偶联，较传统Boc/Fmoc法节能80%；第三，通过建立标准化反应单元（1:1摩尔比，四组分反应体系），在保证产率（>90%）的同时将试剂消耗量降低至传统方法的1/20。实验体系已成功拓展至包含13种异源糖链（包括β-半乳糖苷、α-甘露糖苷、S-半胱氨酸二硫键等）和9类刚性氨基酸（Pro、Phe、Trp等）的复杂合成场景。

在方法学验证方面，研究团队构建了包含27个例子的测试矩阵，覆盖从单糖到多支化糖链（最大达12糖单元）的系统验证。特别值得注意的是，该技术可在肽链中同时引入两种异构糖基（如Core M1/M2双糖基化），且糖苷键的立体化学保持率高达99.7%（通过HPLC与ESI-MS双重验证）。在α- dystroglycan（317-334）多糖基化合成中，成功实现了 Thr317 和 Thr322 的同步糖基化，中间体纯度保持在98%以上，为后续酶促糖链修饰（包括神经氨酸转移酶催化的α2→8唾液酸串联）奠定了基础。

技术整合方面，研究创新性地将微波辅助合成与酶催化技术无缝衔接。例如在Notch-1受体EGF12结构域合成中，通过MateGPT制备O-岩藻糖化单糖胺前体，再经一锅酶化学偶联（含糖基化酶、糖基转移酶、内切酶复合体系），成功构建了具有生物活性的O-岩藻糖化-O-甲基甘露糖双糖基化修饰的受体片段，整体产率达56%，较传统分步合成效率提升3倍。

该技术体系展现出三大核心优势：其一，通过硫酯保护-激活双功能设计，糖基载体可在固相树脂上稳定存在数周，且微波场活化能降低至传统条件的三分之一；其二，反应体系兼容性极强，可无缝对接化学合成、酶催化修饰、蛋白质交联等模块，已成功应用于包含半胱氨酸二硫键、组氨酸磷酸化等复杂修饰的糖蛋白合成；其三，自动化适配性突出，经改造后可集成到现有微波辅助自动合成仪（如T??タス系统），实现每小时2克规模的连续生产。

在应用层面，研究团队展示了三个标志性成果：1）制备了首个人源α- dystroglycan单糖基化全序列模型（317-334），成功分离出包含9种异构糖链的12种糖基变体；2）开发出O-岩藻糖化-Fmoc-L-Thr(α-D-Mannoside)定制化糖基氨基酸库（含47种标准模块）；3）通过模块化组装实现了含三糖链的Notch-1受体EGF12域的合成，该结构为研究糖基化与受体激活的构效关系提供了理想模型。

该技术革新为功能糖组学研究带来革命性改变：首先，将糖蛋白合成周期从传统方法的3-6个月压缩至72小时；其次，建立标准化糖基单元库（已收录152种标准糖苷模块），使糖基替换效率提升至常规方法的5倍；更重要的是，通过精确控制糖基连接位点与构型，首次实现了糖基-肽链的动态可逆连接，为研究糖基动态修饰提供了新工具。

在产业化应用方面，研究团队已建立中试级生产线（200L反应釜），成功实现两种临床前候选药物（抗糖尿病糖蛋白疫苗、肿瘤免疫检查点抑制剂）的连续化生产。其中针对O-岩藻糖化修饰的PD-1抑制剂，通过MateGPT技术将糖基化效率从传统方法的38%提升至92%，纯度达到99.5%，显著优于现有市售产品。

该技术体系已形成完整的知识产权布局，包括：1）微波辅助糖基化反应装置（已获两项发明专利）；2）硫酯化糖基氨基酸库（申请PCT专利）；3）自动化合成工作流（获得CE认证）。产业化应用表明，该技术可使糖蛋白类新药研发成本降低40%-60%，特别在需要多糖基修饰（如>5糖单元）的生物类似物开发中，展现出显著的成本优势。

未来发展方向包括：1）开发低温域（<40℃）微波反应体系以兼容热敏感糖基转移酶；2）构建AI驱动的糖基组合预测系统，实现从基因序列到糖基化模型的自动化生成；3）拓展至RNA修饰合成领域，目前已成功制备含假尿嘧啶和N6-甲基腺苷的RNA-蛋白质杂合体。这些进展将推动糖组学从基础研究向精准医疗的实质性跨越。