在经过基因工程改造的益生菌大肠杆菌Nissle 1917中，果糖驱动5-氨基乙酰丙酸的生物合成过程

高效5-ALA生物合成：基于工程EcN的代谢通路优化与碳源调控研究。通过整合T7RNA聚合酶系统、过表达高效ALAS酶（SahemA）及TCA循环关键酶（pyc、gltA），构建了EcN的模块化代谢工程平台。实验表明果糖作为碳源可显著提升细胞生长和5-ALA产量（摇瓶10.74 g/L，超量生产器9.44 g/L），分阶段补料策略有效缓解代谢瓶颈，且EcN相比商业菌株BL21表现出更优的碳代谢效率和临床适用性。

　　
5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）作为卟啉类化合物的前体，在农业增产和肿瘤光动力治疗中具有重要价值。传统化学合成法存在步骤繁琐、毒性物质多等问题，而微生物生物合成因可再生资源和模块化改造潜力，成为研究热点。然而，现有研究多聚焦于实验室菌株BL21或K-12，这些菌株虽能实现较高产量（如63.39 g/L），但缺乏益生菌安全性认证和肠道环境适应性。本文创新性地以大肠杆菌Nissle 1917（EcN）为底盘细胞，通过代谢通路重构和工艺优化，首次在益生菌体系中实现5-ALA的高效合成（单批次产量达10.74 g/L），为开发临床级生物制造平台奠定基础。

**代谢通路重构策略**
研究团队采用"双路径协同调控"模式突破传统瓶颈。首先，引入溶原性噬菌体T7RNA聚合酶整合系统，通过λ噬菌体位点（ET7L）的整合实现更稳定的转录调控，相比HK022位点（ET7H）的菌株，其5-ALA产量提升近3倍（2.68 g/L vs <1 g/L）。其次，构建多基因协同表达体系：
1. **关键酶优化**：从红衣藓（Sphingobium amiense）中克隆的SahemA基因经定向进化，催化效率较传统ALAS基因提升40%，且在EcN中表现出极强稳定性。
2. **碳代谢流调控**：通过过表达丙酮酸羧化酶（pyc）和草酰乙酸合成酶（gltA）构建TCA循环增强模块，使琥珀酰-CoA前体浓度提升2.3倍。值得注意的是，协同表达pyc和gltA的SYG菌株较单一表达ppc的SP菌株，在碳分配效率上提高18.6%。
3. **前体供应网络**：引入丝氨酸羟甲基转移酶（glyA）增强精氨酸-天冬氨酸途径，配合分阶段补料策略，使关键中间体浓度波动降低65%。

**碳源适配性突破**
研究系统评估了6种碳源对EcN的代谢影响：
- **葡萄糖**：虽能快速启动代谢（OD600达3.8 h），但引发显著醋酸（Ac）和乳酸（La）积累（分别达2.1 g/L和1.8 g/L），碳转化率仅42.3%
- **甘油**：虽支持最大生物量（OD600 3.17），但NADPH/NADP+比值失衡导致ALAS活性下降37%
- **果糖**：展现出独特优势：
1. 利用效率达91.4%（葡萄糖为78.2%），因其EcN特异性转运蛋白FruP的8位点突变（G239A、D241E、S244L）显著增强底物亲和力
2. 氧化还原平衡更优（NADPH/NADP+ 1.82 vs 葡萄糖的1.45）
3. 分解途径主要生成丙酮酸（占比68%）而非乳酸/乙醇酸，更适配C4途径需求
通过同位素示踪发现，果糖经磷酸化后直接进入TCA循环，较葡萄糖需少4步代谢转换，使5-ALA合成效率提升2.1倍。

**动态工艺优化体系**
研究提出"代谢流-环境因子"双维度调控模型：
1. **分阶段补料策略**：
- 阶段1（0-12h）：以果糖为主（5 g/L）维持快速生长（OD600增速达0.18/h）
- 阶段2（12-24h）：加入精氨酸前体（2 g/L glycine）激活C4途径
- 阶段3（24-36h）：补加1 g/L succinate维持关键中间体浓度
该策略使产物合成速率从基础条件（0.023 g/L/h）提升至0.295 g/L/h，达工业菌株BL21的93%水平

2. **氧代谢耦合调控**：
在2.5 L超动态发酵器中，通过调节通气量（DO维持32-38%）和搅拌速度（1800 rpm），使溶解氧梯度差控制在5%以内。结合pH自动调控（6.8-7.2），成功将代谢副产物（Ac+La）总和从基础条件的2.4 g/L降至0.87 g/L。

**工程菌性能验证**
通过多维度比较实验，EcN工程菌株展现出显著优势：
1. **安全性认证**：作为首个通过FDA GRAS认证的益生菌生产平台，其基因编辑仅涉及质粒整合和内源基因过表达，未改变宿主核心代谢通路
2. **规模化效应**：在750 mL反应器中，通过模块化氧控制（DO>35%）和梯度补料（每6小时添加5-ALA前体），实现连续72小时稳定生产，批次间差异系数（CV）<8%
3. **代谢冗余设计**：构建了双备份的TCA循环调控网络（ppc+gltA与pyc+glutA），在单基因失效时仍能维持72%的基础产量

**工业化应用前景**
研究团队已建立完整的工艺包：
- **培养基配方**：MM9基础培养基+10 g/L果糖+2 g/L glycine+0.5 mM PLP+0.2 mM PA
- **发酵参数**：30-37℃恒温，pH自动调控（±0.2），溶氧控制模块（DO传感器+曝气阀联动）
- **后处理工艺**：通过膜分离技术（0.22 μm超滤膜）在2小时内实现产物与细胞的分离，纯度达98.5%

值得关注的是，EcN菌株在持续培养（CD）中表现出更好的适应性：
- 首次传代数达到500代，细胞浓度衰减率仅0.8%/代
- 通过CRISPRi精准敲除血红素合成途径，使5-ALA向血红素转化率从23%降至3.1%
- 抗氧化能力提升：SOD活性达1.85 U/mg蛋白，MDA含量<0.05 μmol/L

该研究不仅刷新了益生菌体系的5-ALA生产纪录，更开创了"临床级工程菌"的构建范式——通过引入EcN特有的糖脂代谢调控网络，在维持其原有益生菌特性的同时，实现了工业化级生物合成需求。未来研究将聚焦于：
1. 开发EcN特异性生物合成调控芯片
2. 构建基于肠道菌群互作的分布式生产系统
3. 开发光控代谢开关实现产物时空精准调控