CXCL12a是一种具有抗菌作用的趋化因子，其C端包含一个螺旋结构片段，该片段在 largemouth bass（Micropterus salmoides）中表现出强烈的抗菌活性

《Fish & Shellfish Immunology》：CXCL12a, an antimicrobial chemokine, contains a C-terminal helical structural fragment that exerts potent antimicrobial activity in largemouth bass ( Micropterus salmoides)

抗感染肽CXCL12a通过破坏细菌膜结构及钙离子不依赖的聚集特性发挥广谱抗菌作用，其C末端肽（MsCXCL12a55-75）在低细胞毒性下保留高效抗菌活性，体内实验证实可降低弧菌感染死亡率，揭示chemokines与抗菌肽的功能趋同。

　　

张彦琦|向阳曦|胡亚珍|李成华

中国宁波大学农产品安全国家重点实验室，宁波，315211

摘要

CXCL12是一种广谱抗菌蛋白，在多种物种中发挥作用，并在先天免疫中起关键作用。然而，其具体结构尚未得到充分研究。在本研究中，我们发现大口黑鲈（Micropterus salmoides）编码一种进化上保守的CXCL12a，该蛋白能够以剂量依赖的方式杀死细菌。MsCXCL12a通过破坏细菌细胞膜、导致细胞质泄漏并最终引发细胞死亡来直接杀死细菌。值得注意的是，MsCXCL12a还具有不依赖钙的细菌聚集特性。通过对MsCXCL12a的二级结构进行结构-电荷分析，我们发现其C端肽段（MsCXCL12a_55-75）保持了广谱且稳定的抗菌活性，同时几乎不具细胞毒性。MsCXCL12a_55-75同样通过破坏细菌细胞膜完整性来杀死细菌。尽管MsCXCL12a_55-75保留了MsCXCL12a的聚集能力，但其聚集效率显著降低。使用被致命剂量的Aeromonas hydrophila感染的大口黑鲈模型，MsCXCL12a和MsCXCL12a_55-75能够显著减少组织中的细菌负荷和死亡率。这些发现强调了趋化因子与抗菌肽之间的功能趋同性。MsCXCL12a_55-75在鱼类模型中的抗菌效果表明其作为新型抗菌治疗候选物的潜力，值得进一步研究其转化应用。

引言

趋化因子是一类小分子分泌蛋白，根据半胱氨酸残基的分布可分为四个亚家族：CC、CXC、XC和CX3C [1,2]。它们通过结合七次跨膜结构域中的受体，在病毒感染、免疫细胞募集、炎症、动脉粥样硬化、造血、血管生成、细胞分化和癌症等方面发挥重要作用 [3], [4], [5], [6]。先前的研究表明，趋化因子在生理pH值下带有强烈的正电荷，并具有与抗菌肽（AMPs）相似的保守三级结构 [7]。因此，许多趋化因子被证实具有抗菌活性。在46种人类趋化因子中，有23种（10种CXC型和13种CC型）具有抗菌活性 [7,8]。趋化因子的抗菌活性与其趋化作用无关，且完全独立于趋化因子受体的特异性 [1,9]。此外，趋化因子可以形成二聚体或更高阶的聚集体，从而在局部产生更高的浓度 [10]。趋化因子同时具有类似AMPs的活性和典型的免疫调节功能，这表明它们在调节抗菌免疫中起着关键作用。

CXCL12（C-X-C基序趋化因子配体12，也称为基质细胞衍生因子-1α，SDF-1α）是一种多功能CXC趋化因子，可影响细胞增殖、迁移、肿瘤发展、存活、血管生成、转移和肿瘤微环境调节 [11]。它由基质细胞、成纤维细胞和上皮细胞在多种组织中分泌，通过与CXCR4和CXCR7受体结合来发挥生理功能 [11], [12], [13]。CXCL12的整体三级结构由二硫键、N端卷曲结构、反平行β链和C端α螺旋组成 [14,15]。CXCL12在脊椎动物中高度保守，包括哺乳动物、鸟类、两栖动物、硬骨鱼类和软骨鱼类，但在不同物种中形式各异 [14]。高等脊椎动物通常只有一个拷贝的CXCL12基因，具有七种不同的剪接变体；而低等脊椎动物（如大口黑鲈Micropterus salmoides）的CXCL12基因由于快速基因进化或物种特异性基因复制而包含多个拷贝 [16,17]。这些发现表明CXCL12在脊椎动物中具有共同的祖先，并在进化过程中发挥了重要的生物学作用。

2003年有研究报道人类CXCL12具有直接的抗菌作用，表明它可能参与宿主对细菌感染的防御，但其抗菌机制尚未明确 [8]。最近的研究表明，CXCL12具有类似于经典AMPs的阳离子和两亲性特征 [14,15]。CXCL12在多种物种中表现出广谱抗菌活性，包括北极七鳃鳗（Lampetra japonica）、姥鲨（Cetorhinus maximus）、草鱼（Ctenopharyngodon idella）、西爪蟾（Xenopus tropicalis）、绿安乐蜥（Anolis carolinensis）、鸡（Gallus gallus）和人类（Homo sapiens） [14]。草鱼中的CXCL12a主要通过攻击酸性脂质并导致膜穿孔来杀死细菌 [14]。它还通过直接的抗菌作用减少组织中的细菌负荷、减轻器官损伤并降低死亡率 [14]。尽管已有研究报道CXCL12具有直接的抗菌活性，但大口黑鲈中的MsCXCL12的抗菌活性仍知之甚少。此外，对CXCL12介导的抗菌机制的理解有限，加上其抗菌机制的复杂性，阻碍了对CXCL12介导的抗菌免疫的全面阐明。

在本研究中，我们首先使用MsCXCL12a作为模型，探讨大口黑鲈中CXCL12的直接抗菌活性和机制是否得到保留。然后，根据其二级结构将MsCXCL12a切割成三个肽段（MsCXCL12a_1–23、MsCXCL12a_24–54、MsCXCL12a_55–75）。进一步分析表明，MsCXCL12a的第三段对其主要的阳离子性质起作用，并具有类似经典抗菌蛋白的特性，提示MsCXCL12a_55–75可能在MsCXCL12的抗菌活性中起关键作用。因此，我们使用MsCXCL12a_55–75来检测其抗菌活性和机制。此外，我们还验证了MsCXCL12a和MsCXCL12a_55–75在体内对抗致命剂量Aeromonas hydrophila感染中的作用。结果揭示了早期脊椎动物趋化因子在抗菌免疫中的进化保守特征，并进一步证明了趋化因子与抗菌肽之间的密切进化关系和功能联系。

伦理声明

实验所用的大口黑鲈（20 ± 5克）来自中国湖州临湖农场。所有实验均遵循宁波大学实验动物中心的指导原则，并获得了宁波大学动物研究伦理委员会的批准。我们尽一切努力减少动物的痛苦。

序列、结构和系统发育分析

CXCL12的cDNA和氨基酸序列来自美国国家生物技术信息中心（NCBI）。染色体定位数据

大口黑鲈CXCL12a是一种进化上保守的阳离子和两亲性蛋白

最近的研究表明，草鱼中的CXCL12a与其他脊椎动物的CXCL12具有保守的结构和功能 [14]。然而，大口黑鲈中CXCL12a的结构和功能是否得到保留尚不清楚。我们发现MsCXCL12a基因由四个外显子和三个内含子组成（图1A）。它编码一个由87个氨基酸残基组成的蛋白质，通过两个二硫键维持其结构，并包含一个SCY特征结构域

讨论

抗菌肽（AMPs）因其阳离子电荷和两亲性特性，通过破坏细胞质膜和通过与微生物DNA/RNA结合进行细胞内干扰等机制，能够快速、广谱地抵御病原体 [23,29]。它们较低的耐药性发展倾向使其成为有前景的下一代抗感染治疗药物 [24]。在本研究中，我们发现大口黑鲈中的CXCL12a具有保守的抗菌活性

合规性和伦理

作者没有财务利益冲突。

作者声明

我们声明本手稿是原创的，之前未发表过，也没有正在其他地方考虑发表。

我们确认所有署名作者均已阅读并批准了本手稿，且没有其他符合作者资格但未列出的人。我们进一步确认手稿中作者的排序得到了所有作者的认可。

所有作者的贡献如下：

张彦琦：研究、方法学设计

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号32325050、32503232）的支持。