《Engineering Microbiology》：Phase variation in
Bacteroides fragilis governs susceptibility to a microvirus and drives its evolution
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噬菌体与宿主Bacteroides fragilis H1的共生进化机制研究。通过分离人粪便中Bacteroidota属感染的Microviridae噬菌体φHBP1，发现宿主通过基因结构变异（如多糖层修饰）产生抗性，而噬菌体通过capsid和pilot蛋白突变实现再感染。该机制揭示了肠道菌群中噬菌体-细菌的协同进化模式，为噬菌疗法扩大宿主范围提供新策略。
潘黄 | 杜美琪 | 刘彦秋 | 韩振豪 | 万倩 | 梁福明 | 韩文远
中国华中农业大学湖北洪山实验室农业微生物国家重点实验室，武汉430070
摘要
人类肠道细菌与其噬菌体之间的相互作用和共同进化塑造了动态的肠道微生物组，对人类健康产生了重要影响。然而，其背后的机制在很大程度上尚未被探索。特别是，关于拟杆菌门（Bacteroidota）和Microviridae噬菌体之间的相互作用模型仍然缺乏，这限制了我们对它们在人类肠道中生态作用的理解。在这项研究中，我们从人类粪便中分离出一种感染拟杆菌门的Microviridae噬菌体φHBP1。φHBP1感染其宿主脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）后，会导致多种基因组结构变化，这些变化与宿主对φHBP1的抵抗力相关。随后，在脆弱拟杆菌H1菌株中对φHBP1进行的进化分析获得了携带衣壳和引导蛋白突变的φHBP1突变体，这些突变体能够重新感染具有抗性的细菌群体。我们的发现为肠道噬菌体与细菌之间的对抗性共同进化机制提供了新的见解，并对通过进化来开发针对耐药细菌的噬菌体疗法具有重要意义。
引言
细菌及其病毒（噬菌体）是人类肠道微生物组的主要组成部分[1]。肠道细菌可以通过其代谢活动直接影响人类健康，而宏基因组学研究也揭示了肠道噬菌体的多样性和丰度与人类健康之间的关联[[2], [3], [4]]。肠道噬菌体可能通过捕食宿主（如裂解细菌并释放细菌细胞内容物，或选择性地杀死优势细菌物种以促进细菌多样性）间接影响人类健康[5,6]。然而，宏基因组学方法无法提供关于肠道噬菌体与其宿主之间关系的确切信息[7]。因此，需要使用特定宿主分离肠道噬菌体并对其进行表征，以阐明噬菌体-细菌相互作用机制。
拟杆菌门是人类肠道微生物群的关键成员，通过降解复杂多糖和生成短链脂肪酸等代谢产物在维持人类健康方面发挥着重要作用[8,9]。然而，某些拟杆菌物种也可能成为机会性病原体。例如，脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）在扩散到血液或周围组织时可能导致严重感染[10]。拟杆菌物种也是多种肠道噬菌体的宿主。特别是拟杆菌属（Bacteroides）是人体肠道中最丰富的噬菌体群——crAss样噬菌体的宿主[[11], [12], [13]]。对拟杆菌-噬菌体相互作用的研究表明，衣壳多糖（CPSs）对于决定噬菌体的敏感性至关重要。拟杆菌可以通过相位变异（phase variation）改变CPS结构以防止噬菌体感染[7,14,15]。噬菌体的敏感性还可能受到相位变异事件的影响，这些事件涉及基因簇或启动子的基因组结构变化，从而改变许多基因的开关表达状态，例如那些参与多糖合成的基因，从而增加细菌的表型多样性和适应性[[16], [17], [18]]。通过相位变异，拟杆菌可以动态生成对噬菌体敏感和耐药的亚群，并与其噬菌体在肠道中长期共存。
尽管已经分离出多种感染拟杆菌的噬菌体[7,[19], [20], [21], [22], [23], [24]]，但这些分离株仅占宏基因组学研究鉴定出的噬菌体的一小部分。例如，Microviridae家族的噬菌体具有较小的（约5 kb）单链DNA基因组和微小的衣壳（直径25-30 nm）[25]，在肠道宏基因组中普遍存在，并已在肠道拟杆菌的基因组序列中被检测到作为前噬菌体[26]，但目前尚未分离出感染拟杆菌门的Microviridae噬菌体。此外，Microviridae是地球上分布最广泛的病毒之一，但已分离出的Microviridae噬菌体数量仍少于大多数其他噬菌体家族[25]。在这项研究中，我们分离出一种感染脆弱拟杆菌的Microviridae噬菌体φHBP1。对φHBP1及其宿主的表征表明，脆弱拟杆菌通过多种基因组结构变化发展出对噬菌体具有抗性的群体，而φHBP1则通过突变重新感染具有抗性的细菌群体。这些发现为肠道噬菌体与细菌之间的对抗性共同进化机制提供了新的见解。此外，由于脆弱拟杆菌是一种机会性病原体，我们对φHBP1的分离和表征对其在噬菌体疗法中的应用具有额外意义。
部分内容摘录
拟杆菌物种的分离
根据已发表的程序[27]分离了拟杆菌物种。从健康的中国捐赠者处收集粪便样本，并用磷酸盐缓冲盐水（PBS，137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na?HPO?和1.8 mM KH?PO?，pH 7.4）进行匀浆处理，同时添加0.1%半胱氨酸。然后将样本稀释并涂布在含有5%羊血的布鲁氏菌琼脂平板上，再添加0.1%卡那霉素（Kan）和0.0075%万古霉素（Van）。平板在37°C下厌氧培养2-3天。
从人类肠道中分离出感染拟杆菌门的Microviridae噬菌体
为了深入了解肠道拟杆菌与其噬菌体之间的相互作用，我们首先从人类粪便中分离出拟杆菌菌株[27]，然后利用这些菌株作为宿主从同一样本中分离噬菌体。我们获得了一种名为脆弱拟杆菌H1的菌株，其基因组大小约为5.4 M，含有5个潜在的噬菌体区域和3个质粒（GenBank: CP186030）（图S1，表S2）。随后的噬菌体分离实验在含有H1的软琼脂上获得了浑浊的噬菌斑（
讨论
噬菌体是地球上最多样化和最丰富的生物实体。尽管已有大量研究分析了噬菌体的生态功能及其与宿主之间的共存和共同进化机制[5,[58], [59], [60], [61], [62]，但这些机制仍大部分未知。特别是，宏基因组学研究揭示了肠道噬菌体的丰富性，强调了它们在调节肠道微生物群落和影响人类健康方面的关键作用[63]。然而，关于个体
结论
我们分离出一种感染拟杆菌门的Microviridae噬菌体φHBP1，并分析了φHBP1与其宿主脆弱拟杆菌H1之间的相互作用。研究发现，脆弱拟杆菌可能通过相位变异产生对噬菌体具有抗性的群体，而φHBP1则通过衣壳和引导蛋白的突变进化以重新感染这些抗性细菌群体。我们的发现揭示了肠道细菌-噬菌体对的共同进化机制，强调了噬菌体进化在扩大宿主范围方面的潜力，为噬菌体疗法提供了新的思路。
数据可用性声明
细菌的原始测序数据已存储在NCBI BioProject中，访问号为PRJNA1258586。噬菌体φHBP1的基因组可通过PV598014在NCBI数据库中获取。脆弱拟杆菌H1的基因组可通过CP186030在NCBI数据库中获取。与本文相关的补充数据可在线获取。
作者贡献声明
潘黄：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 初稿、可视化、验证、项目管理、方法学、研究、正式分析、数据管理、概念化。杜美琪：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 初稿、可视化、验证、研究、数据管理。刘彦秋：撰写 – 审稿与编辑、可视化、方法学、研究。韩振豪：撰写 – 审稿与编辑、研究。万倩：撰写 – 审稿与编辑，
