RAPID-DASH：快速高效的gRNA阵列组装技术推动多重CRISPR-Cas9应用发展

《Synthetic Biology》：RAPID-DASH: Fast and Efficient Assembly of Guide RNA Arrays for Multiplexed CRISPR-Cas9 Applications

本研究针对多重CRISPR-Cas9应用中gRNA阵列构建效率低、耗时长的问题，开发了RAPID-DASH（PCA介导的快速定向组装）技术。该技术通过聚合酶循环组装（PCA）和Golden Gate组装可在单日内完成10个gRNA单元的有序组装，实验验证阵列各位置均保持功能活性，并能构建gRNA阵列文库。该研究为组合遗传扰动研究提供了经济高效的解决方案，并开发了在线设计工具促进技术推广。

　　

在基因组工程领域，CRISPR-Cas9系统已经彻底改变了研究人员精确编辑DNA的能力。这种革命性工具由Cas9核酸酶和引导其到达特定基因组位置的向导RNA（gRNA）组成。然而，当研究需要同时靶向多个基因位点时——例如在 Perturb-seq筛选中解析遗传相互作用，或在细胞谱系追踪中同时编辑多个记录模块——传统的单gRNA递送方法就显得力不从心。

现有 multiplexing（多重）方法各存局限：基于Csy4核酸酶处理的 polycistronic（多顺反子）gRNA阵列末端gRNA功能受损；利用内源性tRNA加工的系统可能干扰细胞正常tRNA池；而通过Gibson组装构建阵列效率低下，特别是当涉及大量gRNA单元时。这些技术瓶颈严重限制了大规模组合遗传扰动研究的开展。

针对这些挑战，不列颠哥伦比亚大学的研究团队开发了名为RAPID-DASH（Rapid Assembly of PCA-produced Individual DNAs and Directed Assembly through typeIIS overHangs）的创新方法。该方法巧妙结合聚合酶循环组装（PCA）和Golden Gate组装的优势，实现了gRNA阵列的快速、高效构建。研究人员证实，利用该技术可在单日内完成包含10个gRNA单元的阵列组装，且各位置gRNA均保持稳健的功能活性。

技术方法核心包括：通过PCA将U6启动子、ssDNA间隔序列和dsDNA终止子 scaffold（支架）组装成单个gRNA单元；利用特异性引物添加BsaI Type IIS限制酶识别位点；通过Golden Gate组装实现gRNA单元的有序连接；使用lacZ蓝白斑筛选和纳米孔测序进行验证。实验采用HEK293T GFP报告细胞系评估gRNA功能，并通过流式细胞术分析编辑效率。

gRNA阵列的高效组装

研究人员通过限制性内切酶消化验证了组装阵列的预期大小（约4kb）。纳米孔测序显示，单个克隆的阵列包含全部10个gRNA且序列正确。更重要的是，对转化子混合物的批量质粒测序表明，81%的组装体包含完整的10个gRNA单元，证明了方法的高效性。

错误率分析与质量控制

对28个gRNA阵列克隆的测序分析发现，7.5%的gRNA单元存在可能影响功能的突变。根据这一数据，筛选4个克隆就有84%的概率获得全长且无有害突变的阵列。虽然研究中仅使用标准脱盐纯化的 oligos（寡核苷酸），但更严格的纯化可进一步降低错误率，为不同实验室提供了灵活性选择。

功能验证证实阵列实用性

利用GFP报告系统评估阵列内各位置gRNA的功能活性。实验设计巧妙：GFP基因起始密码子被突变为GTG而失活，通过Target-AID碱基编辑器将GTG修复为ATG即可恢复GFP表达。将靶向GFP的gRNA分别置于阵列的10个不同位置，结果显示所有位置均能有效激活GFP表达（20.17%-26.53%），显著高于非靶向对照（0.48%）。虽然单个gRNA质粒的效率略高（30.56%），这可能是由于较小质粒转染效率更高以及其他非靶向gRNA竞争有限Cas9资源所致，但阵列各位置gRNA活性的高度一致性证明了该方法适用于多重基因编辑应用。

gRNA阵列文库构建

为展示方法在构建随机组合gRNA阵列文库方面的潜力，研究者在PCA阶段将10种不同的gRNA间隔序列等摩尔混合，模拟商业合成的oligo池。测序分析证实，所有10种gRNA序列均出现在阵列的各位置中，尽管全长阵列比例略有下降（69%）。这种策略理论上可产生100亿（10¹⁰）种独特组合，为大规模组合遗传扰动研究提供了强大工具。更重要的是，由于每个gRNA单元的PCA是独立进行的，研究者可以精确控制每个位置可能出现的gRNA类型，实现特定基因组合的有目的性靶向。

RAPID-DASH技术的主要优势体现在其高效性和经济性上。与传统方法相比，该方法只需为每个新gRNA订购短至59nt的间隔序列，大大降低了成本。整个流程仅需一天实际操作时间，且高效率减少了繁琐的筛选步骤。研究者还开发了用户友好的在线工具（https://deboerlab.shinyapps.io/OligoDesigner/），可自动设计多达20个gRNA单元的组装所需 oligo序列。

尽管目前方法扩展到10个gRNA单元，但理论上通过选择合适的Type IIS限制酶 overhangs（黏性末端）可组装多达52个gRNA单元。不过，超大质粒（约24kb）可能会影响组装效率和阵列稳定性。值得注意的是，包含长重复序列的gRNA阵列与慢病毒递送系统兼容性不佳，因此更适合直接转染、病毒样颗粒递送或PiggyBac系统整合。

该研究的创新之处在于将成熟的PCA和Golden Gate组装技术优化整合，建立了稳定可靠的gRNA阵列构建流程。通过系统评估组装效率、错误率和文库生成能力，为方法在各类基因组工程应用中的推广提供了坚实数据支持。特别值得关注的是，该方法适用于构建 gRNA阵列文库，有望推动大规模组合CRISPR筛选研究，尤其是在需要同时扰动多个基因以解析复杂遗传互作的领域。

综上所述，RAPID-DASH为多重CRISPR-Cas9应用提供了一种快速、经济且高效的解决方案。该方法简化了gRNA阵列的构建流程，使研究人员能够更快地设计、测试和优化复杂遗传扰动实验。随着对复杂生物系统研究需求的不断增长，这种可扩展的gRNA阵列组装技术将在功能基因组学、合成生物学和疾病机制研究等领域发挥越来越重要的作用。